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  • High-content positional biosensor screening assay for compounds to prevent or disrupt androgen receptor and transcriptional intermediary factor 2 protein-protein interactions.

High-content positional biosensor screening assay for compounds to prevent or disrupt androgen receptor and transcriptional intermediary factor 2 protein-protein interactions.

Assay and drug development technologies (2014-09-03)
Yun Hua, Tong Ying Shun, Christopher J Strock, Paul A Johnston
摘要

The androgen receptor-transcriptional intermediary factor 2 (AR-TIF2) positional protein-protein interaction (PPI) biosensor assay described herein combines physiologically relevant cell-based assays with the specificity of binding assays by incorporating structural information of AR and TIF2 functional domains along with intracellular targeting sequences and fluorescent reporters. Expression of the AR-red fluorescent protein (RFP) "prey" and TIF2-green fluorescent protein (GFP) "bait" components of the biosensor was directed by recombinant adenovirus constructs that expressed the ligand binding and activation function 2 surface domains of AR fused to RFP with nuclear localization and nuclear export sequences, and three α-helical LXXLL motifs from TIF2 fused to GFP and an HIV Rev nucleolar targeting sequence. In unstimulated cells, AR-RFP was localized predominantly to the cytoplasm and TIF2-GFP was localized to nucleoli. Dihydrotestosterone (DHT) treatment induced AR-RFP translocation into the nucleus where the PPIs between AR and TIF2 resulted in the colocalization of both biosensors within the nucleolus. We adapted the translocation enhanced image analysis module to quantify the colocalization of the AR-RFP and TIF2-GFP biosensors in images acquired on the ImageXpress platform. DHT induced a concentration-dependent AR-TIF2 colocalization and produced a characteristic condensed punctate AR-RFP PPI nucleolar distribution pattern. The heat-shock protein 90 inhibitor 17-N-allylamino-17-demethoxygeldanamycin (17-AAG) and antiandrogens flutamide and bicalutamide inhibited DHT-induced AR-TIF2 PPI formation with 50% inhibition concentrations (IC50s) of 88.5±12.5 nM, 7.6±2.4 μM, and 1.6±0.4 μM, respectively. Images of the AR-RFP distribution phenotype allowed us to distinguish between 17-AAG and flutamide, which prevented AR translocation, and bicalutamide, which blocked AR-TIF2 PPIs. We screened the Library of Pharmacologically Active Compounds (LOPAC) set for compounds that inhibited AR-TIF2 PPI formation or disrupted preexisting complexes. Eleven modulators of steroid family nuclear receptors (NRs) and 6 non-NR ligands inhibited AR-TIF2 PPI formation, and 10 disrupted preexisting complexes. The hits appear to be either AR antagonists or nonspecific inhibitors of NR activation and trafficking. Given that the LOPAC set represents such a small and restricted biological and chemical diversity, it is anticipated that screening a much larger and more diverse compound library will be required to find AR-TIF2 PPI inhibitors/disruptors. The AR-TIF2 protein-protein interaction biosensor (PPIB) approach offers significant promise for identifying molecules with potential to modulate AR transcriptional activity in a cell-specific manner that is distinct from the existing antiandrogen drugs that target AR binding or production. Small molecules that disrupt AR signaling at the level of AR-TIF2 PPIs may also overcome the development of resistance and progression to castration-resistant prostate cancer.

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产品描述

Sigma-Aldrich
二甲基亚砜, Hybri-Max, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, ≥99.7%
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Sigma-Aldrich
二甲基亚砜, ACS reagent, ≥99.9%
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二甲基亚砜, for molecular biology
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二甲基亚砜, suitable for HPLC, ≥99.7%
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二甲基亚砜, sterile-filtered, BioPerformance Certified, meets EP, USP testing specifications, suitable for hybridoma
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二甲基亚砜, ReagentPlus®, ≥99.5%
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二甲基亚砜, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture
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甲醛 溶液, for molecular biology, 36.5-38% in H2O
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Sigma-Aldrich
二甲基亚砜, puriss. p.a., ACS reagent, ≥99.9% (GC)
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L-谷氨酰胺, meets USP testing specifications, suitable for cell culture, 99.0-101.0%, from non-animal source
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SAFC
甲醛 溶液, contains 10-15% methanol as stabilizer, 37 wt. % in H2O
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L-谷氨酰胺, ReagentPlus®, ≥99% (HPLC)
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二甲基亚砜, BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (GC)
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Sigma-Aldrich
甲醛 溶液, for molecular biology, BioReagent, ≥36.0% in H2O (T)
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SAFC
L-谷氨酰胺
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Sigma-Aldrich
米非司酮, ≥98%
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LOPAC®1280
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二甲基亚砜, PCR Reagent
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Sigma-Aldrich
L-谷氨酰胺, BioUltra, ≥99.5% (NT)
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Supelco
甲醛 溶液, stabilized with methanol, ~37 wt. % in H2O, certified reference material
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Sigma-Aldrich
甲醛 溶液, ACS reagent, 37 wt. % in H2O, contains 10-15% Methanol as stabilizer (to prevent polymerization)
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Sigma-Aldrich
二甲基亚砜, puriss. p.a., dried, ≤0.02% water
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Sigma-Aldrich
二甲基亚砜, anhydrous, ≥99.9%
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LOPAC®1280 (International Version)
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USP
二甲基亚砜, United States Pharmacopeia (USP) Reference Standard
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氟他胺
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N--甲苯磺酰基-L-苯基乙基氯甲基酮, ≥97% (TLC), powder
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Sigma-Aldrich
L-谷氨酰胺, γ-irradiated, BioXtra, suitable for cell culture
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甲醛 溶液, meets analytical specification of USP, ≥34.5 wt. %
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Sigma-Aldrich
L-谷氨酰胺
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