细胞外基质蛋白质和细胞培养优化工具

什么是细胞外基质(ECM)？

动物细胞和组织培养技术不断改进，以优化体外细胞培养条件。细胞外基质(ECM)蛋白质包被，即细胞培养容器的化学或物理修饰，已被证明是更好地模拟体内细胞行为的有效方法。我们在这里将描述可用的各种包被，以及一些新技术亮点。

20世纪，动物组织在玻璃表面培养，但由于需要仔细的清洁程序，因此研究人员开始尝试用聚苯乙烯制成的一次性塑料培养容器^1,2。然而，塑料培养容器有一定的局限性：³

• 在无血清培养基中，细胞难以生长和附着
• 细胞形状、极性和形态变化
• 增加细胞增殖，减少分化
• 对激素和生长因子的反应性较低

然后研究人员开始用生物材料（生物包被）和合成聚合物（化学包被）来包被容器，这些材料可以增强细胞的附着、生长和分化。与在平坦的2D塑料表面上生长的细胞不同，包被表面上的细胞生长更接近自然环境。该技术可以被认为是生理2D环境或2.5D细胞培养条件。

在生物（细胞外基质蛋白）或化学（聚赖氨酸......）包被存在下培养的细胞，比在传统的2D细胞培养条件下培养的细胞，经历更多的生理学相关行为。

ECM蛋白质

组织不仅只是紧紧堆积在一起的细胞，而是其大部分体积包含细胞外空间，并且充满了称为细胞外基质（ECM）的复杂的蛋白质网状结构。大多数组织中的ECM的组分由成纤维细胞分泌，分为蛋白多糖和纤维蛋白（胶原蛋白、明胶、纤连蛋白和层粘连蛋白）。⁴这些组分提供结构支持并促进细胞的通信。整合素是细胞表面上的跨膜蛋白，它将细胞的细胞骨架连接到ECM，激活调节细胞增殖、形态、贴壁和细胞死亡的信号通路。  

层粘连蛋白

层粘连蛋白是基底层的主要成分。它由三条长的多肽链（称为α、β和γ）组成，这些多肽链通过二硫键连接在一起，并以不对称的十字形排列。层粘连蛋白起胶水作用，将细胞和ECM保持在一起。它具有胶原蛋白结合、细胞粘附、肝素结合和神经突向外生长片段的活性结构域。层粘连蛋白调节细胞生长、运动性和信号通路^3,8。

纤连蛋白

纤连蛋白是一种大的糖蛋白（220 kDa），由两条多肽链（二聚体）组成，多肽链的一端连接有二硫键。每个多肽进一步折叠成功能和结构上不同的结构域，其结合ECM的各种组分（糖胺多糖、蛋白多糖和胶原蛋白）以及细胞表面蛋白。  纤连蛋白由多种结缔组织细胞分泌，包括：成纤维细胞、软骨细胞、雪旺细胞、巨噬细胞、肠上皮细胞和肝细胞⁷。

纤连蛋白是参与细胞粘附和扩散的多功能蛋白质。它还调节细胞形态、细胞迁移、细胞骨架组织、止血和伤口修复。

胶原蛋白

胶原蛋白是哺乳动物中最丰富的蛋白质，占总蛋白质量的25％。它由三条多肽链（称为α链）组成，以螺旋构象排列，富含甘氨酸和脯氨酸残基。  有20多种不同类型的胶原蛋白，其中胶原蛋白 I、II、III、V 和 XI 是通常在结缔组织中发现的纤维状胶原蛋白。胶原蛋白 IX 和 XII 是原纤维相关的胶原蛋白，其将原纤维彼此连接，并连接到细胞外基质的组分。而 IV 型和 VII 型胶原蛋白是构成网络的胶原蛋白，构成基底层的主要部分。⁵

在组织中，胶原蛋白提供结构支持、强度和弹性，在细胞培养中，它用于研究细胞的生长、分化和迁移⁶。

明胶

明胶存在于胶原蛋白中，是一种具有高平均分子量的水溶性蛋白质的异质性混合物。通过在水中将相关的皮肤、肌腱、韧带和骨骼进行煮沸来提取蛋白质。A类明胶来自于酸固化组织，而B类明胶来自于石灰固化组织。

猪皮来源明胶又称A类明胶，由胶原蛋白酸性酶解产生，主要成分为甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸。这种明胶在三螺旋胶原蛋白酶解后呈随机卷曲结构，与 B 类牛明胶的 N 末端序列不同。

明胶常用于改善细胞附着，以及以及胚胎干细胞培养、睾丸细胞培养和神经上皮样结构的细胞培养板或培养皿的包被。

玻连蛋白

玻连蛋白是459种氨基酸的糖蛋白，存在于ECM和血液中。它以75 kDa的单链基团形式或以65 kDa和10 kDa双链基团形式在血液中循环。玻连蛋白与多糖（糖胺多糖）和蛋白多糖相互作用，充当细胞粘附分子。虽然玻连蛋白和纤连蛋白具有相似的功能，并具有Arg-Gly-Asp细胞识别序列，但它们在结构和免疫学上是不同的。⁹

玻连蛋白作为细胞溶解补体途径的抑制剂，具有凝血途径的生理作用。此外，它还促进内皮细胞和肿瘤细胞的细胞迁移、增殖、分化和扩散。

化学和合成包被：聚赖氨酸和聚鸟氨酸

合成聚合物（聚氨基酸）包被促进细胞和蛋白质的附着。聚赖氨酸和聚鸟氨酸等聚氨基酸在聚苯乙烯上产生正电荷，并增加可用于细胞结合的带正电荷的位点。¹¹它们还与附着因子组合使用，所述附着因子可以加强细胞膜的负离子和培养物表面附着因子的正离子间的静电相互作用。

即用型预混合附着因子溶液

我们的即用型预混合附着因子溶液用于包被细胞培养瓶和培养板，促进需要黏附在 ECM 包被表面上的多种细胞附着、分化和增殖。传统的细胞培养方法涉及耗时的预处理步骤（包括用各种附着因子包被板），可能导致整个检测时间拖长。这些附着因子混合溶液有助于简化细胞培养物制备，减少终端用户的优化工作，最大限度地缩短所需的步骤和时间并减少洗涤试剂用量。研究人员还可在包被培养板的当天开始检测，无需在添加第二种附着因子之前等待过夜。附着因子混合液工作浓度经过预先优化，可直接用于 10 x 96 孔板，无需稀释。

附着因子混合液应用

层粘连蛋白与聚-L-赖氨酸 (PLL)、聚-L-鸟氨酸 (PLO) 或聚-d-赖氨酸 (PDL) 的组合通常用于培养上皮细胞和神经元细胞，促进其附着和分化。这些混合物可室温储存，且相对于单独的层粘连蛋白更稳定——后者需要-20°C储存且容易因反复冻融而变性。细胞可酶解聚-L-赖氨酸时，建议将层粘连蛋白与聚-D-赖氨酸混合使用，以防止过量酶解L-赖氨酸。

为验证即用型层粘连蛋白混合液的有效性，使用两种包被方法培养神经干细胞 (NSC) 进行对比。在标准方法中，PLL/PLO/PDL 和层粘连蛋白一起孵育，然后洗涤并第二次过夜孵育。使用我们新的简化方法，将 PLL (LPLL001)、PLO (LPLO001)或PDL (LPDL001)与预混合的层粘连蛋白包被溶液一起37°C孵育 1 小时。 使用即用型包被溶液混合物进行 NSC 附着和增殖的结果如图示（图 4-6）。

我们的纤连蛋白- 明胶包被溶液混合物适用于无血清或低血清培养，尤其适合培养HL-1心肌细胞系和内皮细胞。

如图7所示，在纤连蛋白/明胶包被溶液(FG001)上培养不同细胞系（BHK21 细胞、CHO 细胞、F9 细胞和 HL-1 心肌细胞系）。所有细胞系均表现出出色的附着和增殖能力，证实了即用型纤连蛋白-明胶包被溶液的有效性。

我们即用型、预混合附着因子溶液为细胞培养分析提供了一种省时高效的替代方案，研究人员可在包被平板的当天开始实验。所得的实验结果证明了这类混合物适用于各种细胞类型，因而成为简化细胞培养实验并提高成功率的宝贵工具。

细胞粘附包被联板和板

Millicoat^® 细胞粘附联板

Millicoat^®细胞粘附联板是 12 个可拆卸的 8 联板，安装在板框内，为设计细胞测定方案提供了便利和灵活性。A-G行中的孔已预先包被了ECM蛋白（如纤连蛋白或玻连蛋白)，而H行则以BSA包被，作为阴性对照。然后可以将细胞接种到包被表面上，并对贴壁细胞进行固定和染色。

Cytosoft板

细胞生长基底的刚性影响细胞功能。CytoSoft^®板涂有很薄的一层生物相容的硅胶，其具有多种刚性，可覆盖广泛的生理学范围。凝胶表面形成与蛋白质稳定相连的共价键，促进凝胶包被附着因子（ECM组分）和细胞接种。CytoSoft^® 板具有以下特性：

• 透光性好，自发荧光低
• 硅凝胶不易水解
• 硅凝胶稳定，不会干燥或膨胀
• 抗撕裂或开裂
• 在长期储存期间刚性几乎没有变化
• 胰蛋白酶和胶原蛋白酶可用于收获细胞
• 酶处理后抗生化分解

细胞培养使用的其他ECM蛋白

用ECM蛋白和合成聚合物包被培养表面后极大地影响细胞行为。观察到的响应取决于细胞类型和用作底物的包被。与附着因子接触的细胞存活时间更长，并且还可以在不含血清因子的情况下生长。³附着因子可以隔离和储存生长因子，从而控制因子的时空调节，并促进生长因子受体与ECM受体之间的相互传导。它还决定了机械特性，并指示细胞在允许条件下进行分化。ECM蛋白还通过细胞表面受体与生长因子信号传导协同诱导细胞内信号传导。¹²随着细胞培养技术的发展，需要更多的组分和组合来更好地模拟组织的体内条件，并破译细胞之间细胞外基质的语言。