免疫印迹膜剥离和重新检测

免疫印迹是研究蛋白质功能和定位的常用技术。通常，蛋白质样品可在SDS-PAGE上分离并转印至硝酸纤维素膜(NC膜)或PVDF膜上，然后用特异性抗体进行检测。与可重复利用Southern和Northern印迹的核酸技术不同，免疫印迹很难重复使用。

免疫印迹的剥离和重新检测技术具有以下几个优点：

1. 有利于昂贵或量少或珍稀样本的多次杂交；
2. 有利于用不同抗体分析单次印迹上的不同蛋白，比如不同亚型的抗体；
3. 有利于对异常结果进行重分析或确认；
4. 有利于纠正孵错的抗体；
5. 节约试剂成本，并节约时间。

目前已经公布了几种用于从免疫印迹上剥离抗体的方案，包括低pH、加热和去垢剂以及离液剂等方法。以下是三种推荐方案。第一种方案适用于任何化学发光底物系统，即通过加热和去垢剂的组合来解离抗体。第二种常用于抗体必须与抗原分离的应用，即采用低pH值来改变抗体的结构，使结合位点失活。

第三种方案利用具有特殊配方的ReBlot™ Plus Western Blot Recycling Kit（抗体剥离试剂盒）从免疫印迹膜上剥离抗体。该方法的优势在于：

• • 避免吸入与β-巯基乙醇有关的刺激性气味。
• • 可在室温条件下处理。
• • 可在15分钟内剥离抗体。

这些方法都不能去除显色检测系统所产生的有色沉淀（如BCIP、4CN、DAB和TMB）。但是，仍可以利用靶向不同目标蛋白的另一种抗体来分析印迹。

通常，这些方案仅能用于定性用途，除非已经确定剥离过程不会影响指定抗原的定量结果。许多抗原将经历至少5次剥离循环，具体取决于所用的方法和膜类型。但是，应该考虑到在每个剥离循环中，都将洗去少量的膜固定蛋白。如果需要连续检测几种抗原，建议从预期丰度较低或产生信号较少的抗原开始。

在设计具有一轮或多轮抗体剥离的免疫印迹实验时，可参考以下建议。

• • PVDF膜比硝酸纤维素膜更坚韧，因此推荐用于任何涉及抗体剥离的方案。
• • 从SDS-PAGE凝胶转印完成后立即干燥PVDF膜，可改善蛋白质与膜的结合，特别推荐用于涉及多次剥离的实验。在第一轮免疫检测之前，必须使用乙醇将干燥的PVDF膜润湿。
• • 优先检测低丰度抗原。
• • 先使用亲和力低的抗体，再使用高亲和力抗体。
• 重要提示：尽管建议在转印后立即干燥PVDF印迹，但不可在两轮免疫检测之间干燥印迹，否则，任何残留的抗体分子将与膜永久结合。

方案1：通过加热和去污剂剥离

所需设备和溶液

• • 标准印迹或印迹条，在硝酸纤维素或PVDF膜上。
• • 封闭液。
• • 剥离溶液：100 mM 2-巯基乙醇 (M3148)、2% (w/v) SDS (L3771)、62.5 mM Tris-HCl (T6666), pH 6.7。
• 磷酸盐缓冲盐（PBS）：10 mM 磷酸钠、pH 7.2，0.9%（w/v）NaCl。
• • 浅托盘，能容纳膜
• • 阳性和阴性剥离对照。

操作流程

1. 在通风橱内，将印迹放入剥离溶液中，50 °C摇动孵育30分钟。
2. 将印迹放入缓冲液中，摇动10分钟。使用新鲜的缓冲液重复一次。
3. 可选: 重复初始检测操作（省略一抗步骤），
4. 以确保抗体已失活或从膜上剥离。
5. 将印迹放入缓冲液中，摇动10分钟。
6. 继续进行封闭步骤，进行下一轮的免疫检测。

方案2：通过低pH值剥离

所需设备和溶液

• • 标准印迹或印迹条，在硝酸纤维素或PVDF膜上。
• • 封闭液。
• • 剥离溶液：25 mM 甘氨酸-HCl (G2879), pH 2,1% (w/v) SDS (L3771)。
• 磷酸盐缓冲盐（PBS）：10 mM 磷酸钠、pH 7.2，0.9%（w/v）NaCl。
• • 浅托盘，能容纳膜
• • 阳性和阴性剥离对照。

操作流程

1. 将印迹放入剥离溶液中，摇动孵育30分钟。
2. 将印迹放入缓冲液中，摇动10分钟。使用新鲜的缓冲液重复一次。
3. 继续进行封闭步骤，进行下一轮的免疫检测。

方案3：利用ReBlot™ Plus Western Blot Recycling Kit（抗体剥离试剂盒）剥离抗体

Re-Blot Plus Mild抗体剥离液对硝酸纤维素和PVDF膜均具有良好的剥离效果。但在待剥离膜具有较高信号或Re-Blot Plus Mild处理不充分时效果更好。

所需设备和溶液

• • 标准印迹或印迹条，在硝酸纤维素或PVDF膜上。
• • 封闭液。
• • 保鲜膜，用于保存不会立即再次检测的印迹。
• • ReBlot™ Plus Kit（抗体剥离试剂盒）
• • 蒸馏水，用于稀释试剂。
• • 浅托盘，能容纳膜
• • 阳性和阴性剥离对照。

操作流程

注意：若要重复使用印迹或单个印迹条，应在第一次使用后立即剥离。如果不能立即剥离，应将膜包在保鲜膜中并置于PBS中，保存在4°C。切勿将印迹干燥保存。

1. 在塑料托盘中加入适量的1X Antibody Stripping Solution（试剂盒中提供）
2. 用镊子将印迹或印迹条浸入剥离液中。在室温下，轻轻混合孵育15分钟。在一个干净的塑料托盘中装入相同量的封闭液。
3. 可使用传统的封闭液，如20 mM Tris HCL、pH 8.0，150 mM NaCl，0.1% 吐温20，5%奶粉，或者类似溶液。
4. 使用封闭液清洗印迹2次，每次5分钟。
5. 现在，可使用抗体再次检测印迹。