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WB检测样本前处理:细胞裂解和蛋白提取

从细胞或组织(新鲜或冷冻)中提取蛋白质的所有步骤必须在2-8°C下进行。以下是用于制备蛋白质样品的一种常见裂解缓冲液的成分。访问计算器页面获取缓冲液及其他用于Western blotting溶液的配方列表。

用于蛋白质提取的RIPA缓冲液即用型溶液(货号:R0278

蛋白酶抑制剂-不要在样品准备过程中丢失蛋白质

蛋白质提取实验方案步骤

  1. 将含有细胞的培养皿中的培养基丢弃,用冰冷的PBS洗涤细胞。
  2. 丢弃PBS,加入冰冷的裂解缓冲液。
  3. 使用冷塑料细胞刮刀刮擦细胞。收集微量离心管中的细胞。
  4. 将微量离心管中的内容物在4℃下搅拌30分钟。
  5. 将离心管在4℃下以16,000 x g离心20分钟。将上清液收集在新管中并置于冰上。丢弃沉淀物。

从细胞悬液提取蛋白质

  1. 将细胞悬液在4℃下以2,000 x g离心5-7分钟。细胞将聚集于试管底部,弃去上清液。
  2. 向细胞沉淀中加入冰冷的PBS,并在4℃下以2,000 x g离心5-7分钟洗涤细胞。
  3. 向细胞沉淀中加入冰冷的裂解缓冲液。将微量离心管中的内容物在4℃下搅拌30分钟。
  4. 将离心管在4℃下以16,000 x g离心20分钟。将上清液收集在新管中并置于冰上。丢弃沉淀物。

从组织中提取蛋白质

  1. 在冰上切割要研究的组织。将组织转移到圆底离心管,浸入液氮快速冷冻。
  2. 对于5 mg组织,加入300 μL冰冷的裂解缓冲液,使用电动匀浆器均化。在均质化过程中另再添加300-600 μL裂解缓冲液。
  3. 在4℃下搅拌内容物2小时。
  4. 将离心管在4℃下以16,000 x g离心20分钟。将上清液收集在新管中并置于冰上。丢弃沉淀物。

均一化样品总蛋白质浓度

  1. 取少量裂解物进行蛋白质估算测定。
  2. 通过与标准样品比较确定未知样品的蛋白质浓度,确保将标准样品稀释到与未知样品相同的缓冲液中。蛋白质估算可以使用 考马斯蛋白质测定试剂(货号 27813)、BCA 测定、280nm吸光度。
  3. 将适当体积的裂解物转移到微量离心管中,使得所有样品都含有相同的总蛋白质浓度。
  4. 加入足够的冰冷裂解缓冲液,使所有裂解物具有相同的体积。

将样品与Laemmli上样缓冲液混合

以下是制备电泳样品所需的上样缓冲液的成分。

2X Laemmli上样缓冲液:

  1. 向一定量的细胞裂解物中加入等量的上样缓冲液。
  2. 将上述混合物在95℃下煮沸5分钟。16,000 x g离心5分钟。
  3. 这些样品可以在-20°C下储存,也可以用于进行凝胶电泳。

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