选择qPCR参照基因的实验方案

PCR 技术方案目录

qPCR条件优化

QPCR 条件的优化对于制定稳健的检测方案非常重要。优化不佳的表现是重复样本之间缺乏再现性，以及检测低效且不灵敏。两种主要优化方法是优化引物浓度和/或退火温度。

基因表达数据的分析需要稳定的参考或上样控制。所述参考通常是一个或多个参照基因。合适的参照基因是指那些不受样品和实验处理差异影响的基因，必须为每个实验模型确定这些基因。当进行试验以选择稳定的参照基因时，所选择的基因必须来自不同的生物途径，并且它们的表达是独立调节的，这些要求至关重要。所有候选参照基因最好在选择的五个测试样品和五个对照样品上进行测试。 

设备

• 定量PCR仪器
• PCR设置的层流罩（选购件）

试剂

• 以1:100稀释的cDNA（更稀释的cDNA通常足以检测高表达的参照基因，对于中等表达的基因，使用1:10稀释）。
• KiCqStart^® SYBR^® Green ReadyMix™（KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03—取决于仪器，见表 P4-6）。
• PCR级水：PCR级水（W1754或W4502），20mL等分试样；冻存；每次反应均使用新鲜的等分试样。
• 测试参照基因的正向和反向引物（10 μM的原液）。注意： 表 P15-37提供了合适的基因列表。这些可以用作KiCqStart^®引物，它们是预先设计的测定（引物序列随产品提供）。 

耗材

• 无菌过滤器移液管吸头
• 无菌 1.5 mL 螺旋盖微量离心管 (CLS430909)
• PCR管和PCR板，选择一种以匹配所需格式：
  •    单个独立的薄壁200μLPCR管（Z374873或P3114）
  •    孔板
        - 96孔板 (Z374903)
        - 384孔板 (Z374911)
  •    孔板密封
        - ThermalSeal RTS™ 封膜 (Z734438)
        - ThermalSeal RT2RR™ 封膜 (Z722553)

本方案注意事项

• 使用ReadyScript^®RT试剂盒生成cDNA，该试剂盒包含随机引发和oligo-dT引发的组合（参见标准逆转录方案（两步法）和逆转录）。
• 如果使用 PCR 板，请按照板示意图进行操作，以确保将反应混合物、样品和对照物加入到正确的孔中。
• 测试可能成为参照基因的多种基因。这些基因应该在不同的功能基因途径中表达。
  表 P15-37给出了一些模式生物的可能的KiCqStart^® SYBR^® 引物选择。OligoArchitect是替代引物设计的合适设计工具（参见OligoArchitect™试验设计和PCR/qPCR/dPCR试验设计）。

方法

1.    计算每个参照基因所需的反应数。制备足以对每个
样品进行两次反应的混合物。例如，如果测试5个试样和5个对照样品以及两个无模板对照（NTC）= 22个反应物。另外多制备
10％的混合物以备发生移液错误时补充。

2.    根据表P15-38为每个参照基因引物对制备qPCR预混液。请勿在预混液中添加cDNA
。混合均匀，避免气泡。

3.    向标记好的管/孔中加入15 μL预混液。

4.    加入5 μL适当的模板（将用于NTC的样品或水加入到标记好的管/孔中）。

5.    给试管盖上盖子或封板，并贴上标签。（确保标签不会遮挡仪器的激发/检测光路。）

6.    根据以下三步方案操作反应物（表P15-39）。重复执行第1-3步40次。

7.    参见以分析数据，并确定最稳定的参照基因或基因组合。

说明：使用标准解离曲线实验方案（数据收集）。