KiCqStart™通用SYBR® Green qPCR实验方案
背景
KiCqStart®SYBR® Green qPCR ReadyMix是2X浓缩的即用型反应混合物，含有除引物和模板外的实时定量PCR (qPCR)所有组分。这种专有缓冲液、稳定剂和KiCqStart® Taq DNA聚合酶的独特组合使用SYBR® Green qPCR的快速或常规循环方案，提供最高的PCR效率、灵敏度、特异性和稳定的荧光信号。
高特异性扩增对于使用SYBRSYBR® Green I染料技术成功进行qPCR至关重要，因为该染料可结合扩增过程中产生的任何dsDNA并进行检测。KiCqStart® Taq DNA聚合酶含有专有的单克隆抗体混合物，可与聚合酶结合并在PCR预变性步骤之前保持其无活性（室温下>48小时）。酶的活化在95 °C下瞬时完成。60 °C下，在不到20秒的时间内即可完成高达200 bp的片段复制。
详情请参阅qPCR技术指南或基于SYBR® Green I的qPCR技术动画。
耗材
- KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ (KCQS00, KCQS01, KCQS02 或 KCQS03 – 根据使用的qPCR仪器选择合适的试剂)
- 正向和逆向引物，稀释至工作浓度（10 μM工作原液足以进行大多数检测）
- 在此订购定制的寡核苷酸
- 预先设计的基因表达引物也适用于大多数模型生物 (KiCqStart® SYBR® Green Primers, KSPQ12012)
- 无菌过滤器移液管吸头
- 无菌1.5 mL螺纹盖微量离心管（例如CLS430909）
- PCR管，选择匹配所需形式的试管：
- 单个薄壁200 μL PCR管（Z374873或P3114）
- 平板
- 96孔板（Z374903）
- 384孔板（Z374911）
- 封板膜
- ThermalSeal RTS™ 密封膜（Z734438）
- ThermalSeal RT2RR™ 薄膜（Z722553）
- PCR级纯水（W1754）
检测指南
- 引物设计：
- 预先设计的引物：我们提供了一组预先设计的引物，这些引物已经过优化，可与KiCqStart® SYBR® Readymixes。这些KiCqStartt® 引物可通过货号KSPQ12012订购.
- 定制引物：
- 高特异性引物的设计是使用SYBR® Green I染料成功进行实时PCR最重要的参数。鼓励使用计算机辅助引物设计程序，以使每个引物和引物对内3'末端内部二级结构和互补的可能性最小化。 定制底物可通过货号OLIGO订购。
- 扩增子大小：KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™可以很容易地扩增400到500 bp的片段；但是，要充分利用快速循环方案，扩增子大小应限制在150 bp以下。
- 引物浓度：最佳结果可能要求引物滴定浓度为100至500 nM。300 nM的引物终浓度为对绝大多数反应有效。
- 反应构建：
- 建议制备反应混合物以减少移液误差并使分析精度最大化。将反应混合物与除样品模板（基因组DNA或cDNA）之外的所有所需组分混合，然后将等分试样分配到独立的反应管中。最后一步，将DNA模板添加到每个反应中。对模板样品进行稀释，至少添加5 µL，这样可提高检测精度。
- 推荐的模板起始量：对应于总RNA为1pg至100ng的cDNA；100 pg至100 ng基因组DNA
反应构建
* 95 ºC下，KiCqStart Taq DNA聚合酶可在1秒内完全激活；但是，最佳预变性时间依赖于模板，并且将影响qPCR的效率和灵敏度。扩增基因组DNA或超螺旋质粒DNA靶标在95 ºC下可能需要5到10分钟才能使模板完全变性并解链。短链双链DNA模板（PCR产物）或单链DNA模板在95 ºC下可能只需要1秒。95 ºC下，使用30秒作为通用起点。
† 延长时间取决于扩增子长度和qPCR仪器的最小数据收集时间要求。一些引物组获得最佳性能需要执行3步循环方案。对于给定的引物组和实时仪器，需要凭经验确定最佳退火温度和时间或引物浓度。
材料
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