标准逆转录方案（两步法）

逆转录

逆转录(RT)是指使用逆转录酶和dNTP将RNA转化为cDNA的过程。

该过程既可对总RNA进行RT步骤，从而产生代表样品中所有RNA转录本的整体cDNA（通常通过两步法），也可通过基因特异性方法，仅将目标RNA转化为cDNA（通常遵循一步法）。

下述实验可用作RT基础实验方案，供研究人员对其进行修改以满足特定要求。通常使用两步法制备cDNA，随后在加入PCR / qPCR体系之前对cDNA进行稀释，或者通过一步法反应进行制备，依次进行两个过程。

设备

• 标准 PCR 仪或加热块
• 用于 RT 设置的层流罩（选配）

试剂

• RNA（原液约 1 μg/μL）。
• ReadyScript^® 两步cDNA 合成试剂盒 (RDRT)。可选逆转录试剂盒也可与 oligo-dT 引物和/或随机引物联合使用。
• PCR级水：PCR级水（W1754或W4502），20mL等分试样；冻存；每次反应均使用新鲜的等分试样。

耗材

• 无菌过滤器移液管吸头
• 无菌 1.5 mL 螺旋盖微量离心管 (CLS430909)
• PCR管和PCR板，选择一种以匹配所需格式：
  • 独立的薄壁200 μL PCR管（Z374873或P3114）
  • 板
    - 96孔板（Z374903）
    - 384孔板（Z374911）
  • 封板膜或盖
    - ThermalSeal RTS™封膜（Z734438)
    - ThermalSeal RT2RR™膜（Z722553）

方法

准备

1. 将 ReadyScript^®试剂盒组件和RNA样品置于冰上。
2. 混合然后短暂离心以收集管底部的内容物。

反应

1. 确定所需的反应（包括控制）数量。根据表P10-26计算所有反应所需各组分的体积（移液误差允许额外增加 10%），并使用0.2 mL管或 96 孔板置于冰上合并试剂。如果使用 PCR 板，请按照板示意图进行操作，以确保将试剂添加到正确的孔中。

2. 对各反应密封后，轻轻涡旋混合内容物。短暂离心，收集反应管底部的组分。
3. 根据表P10-27培育反应混合物。

4. cDNA 合成完成后，用 1：5～1：10 的第一链反应 (2—4 μL) 进行 PCR 扩增。  
   注意： 使用 ReadyScript^®试剂时，可在PCR中加入2–4µL未稀释的cDNA，而不会引起抑制。如果需要，cDNA 产物可用 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)和0.1 mM EDTA 稀释，在 -20°C 保存。