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主页新一代测序SeqPlex 增强型DNA扩增试剂盒 (SEQXE)实验方案

SeqPlex 增强型DNA扩增试剂盒 (SEQXE)实验方案

产品描述

面向全基因组扩增(WGA)的SeqPlexDNA扩增试剂盒(SEQXE)专用于对极小量或降解/高度片段化的DNA进行下一代测序(NGS)。染色质免疫沉淀(ChIP)或福尔马林固定的石蜡包埋组织样品(FFPE)的DNA含量往往无法满足成功制备下一代测序文库的需求。通过SeqPlex试剂盒可对这类DNA以及其他用于NGS的小量/高度片段化DNA样品进行预扩增。 

SeqPlex流程包含三个步骤:预扩增、扩增和引物去除。参见以下SeqPlex工作流程图。  

SeqPlex 工艺流程

第一步:预扩增,使用由半简并3 '端和通用5 '端组成的引物复制DNA。随着聚合过程的进行,将置换的单链作为新模板进行额外的引物退火和延伸。预扩增产物由随机的重叠扩增子组成,这些扩增子的侧翼序列为通用末端序列。

第二步:扩增,利用单引物PCR通过通用末端序列对预扩增产物进行扩增。SeqPlex扩增产物范围为200-500个碱基对。来自ChIP的扩增子和/或降解DNA,如FFPE,通常较短并且取决于起始DNA的长度。

第三步:引物去除,从扩增子池中去除引物和半简并序列,使SeqPlex DNA可立即用于NGS工作流程。

所含试剂

储存方法/稳定性

所有组分应储存在-20°C条件下。解冻使用时,所有组分应保存在冰上。通过在37℃条件下短暂加热并充分混合,以溶解溶液中的任何可能沉淀物。若储存在–20 °C以上环境或长期放置在4 °C以上环境中,会影响文库制备酶和引物去除酶的稳定性。

操作流程

以下步骤已成功用于扩增和测序100 pg的ChIP分离DNA和100 pg的片段化基因组DNA。受损DNA,如从FFPE组织中分离出来的DNA,可能需要5-10倍的起始DNA量——具体取决于DNA的受损程度。反应可以放大或缩小,以便制备所需数量的扩增DNA。

注意:扩增和引物去除后的最终得率很大程度上取决于起始DNA的量。在大部分情况下,可得到1-2μg。多次反应可获得更多产物。

注意:该操作步骤是应使用本试剂盒随附或推荐使用的试剂开发的。更换试剂可能无法获得最佳结果。

预扩增

  1. 为获得最佳的SeqPlex扩增覆盖度和NGS结果,最佳起始DNA大小为200-500bp。许多ChIP和FFPE样品的DNA已经在此范围内。在SeqPlex实验方案的第4步之前,这些样品不需要额外的片段化处理。
    如果起始DNA不在200-500 bp范围内,强烈建议进行片段化处理。使用超声处理、Covaris仪器或者酶解法均可将DNA片段化。

  2. 尽可能通过紫外吸收(260 nm)测定DNA浓度,并且每个反应最多使用1 ng DNA。

  3. 解冻文库制备缓冲液(LP100)、5x扩增缓冲液(A5112)和水 (W4502)。充分混匀。

  4. 按下述方法添加溶液:
        2 µL 文库制备缓冲液 (LP100)
        X µL DNA(最多1 ng)
        Y µL水 (W4502)
        --------------------------------------------------
        14 µL 总反应体积

    注意—GenomePlex® WGA资深用户:SeqPlex增强型DNA扩增试剂盒(SEQXE)、SeqPlex DNA扩增试剂盒(SEQX)、GenomePlex WGA试剂盒、Transplex®WTA1试剂盒和完整全转录组扩增试剂盒(WTA2) 中的几个组分具有相似的名字。尽管它们的功能相近, 但不可互换使用。

  5. 充分混匀,短暂离心,然后在热循环仪中以下列程序孵育:
        95 °C,2分钟
    4 °C,保温

  6. 样品冷却至4°C后,加入1 µL文库制备酶(E0531)。盖上管盖并充分混匀。短暂离心并立即进入下一步。

  7. 将反应置于热循环仪中
    并以下列程序孵育:
        16 °C,20分钟
        24 °C,20分钟
        37 °C,20分钟
        75 °C,5分钟
         4 °C,维持

  8. 从热循环仪中取出样品并短暂离心。可立即完成扩增或将预扩增产物在-20 °C保存最长3天。

    注意—GenomePlex WGA资深用户:
    · SeqPlex使用5x扩增混合液
    · 推荐使用SYBR Green (S9430) 监测扩增过程
    · 退火/延伸温度为70 oC
    · 扩增后需要在 70 oC 维持 30 分钟


  9. 在第8步获得的15 mL预扩增产物中加入下列试剂。(多次反应可能需要制备预混液。向每个反应中加入60 mL预混液):
        15 µL 5X 扩增混合液 (A5112)
        1.5 µL SeqPlex DNA聚合酶 (SP300)
        42.5 µL  (W4502)
        1 µL 稀释1/1000的 SYBR Green I (S9430) *
        - µL 仪器专用参比染料(可选)
        --------------------------------------------------
        75 µL总反应体积

*为了获得最好的效果,强烈建议在进行实时PCR时在扩增反应中加入SYBRGreen I,以监测反应过程。为避免抑制扩增反应,SYBRGreen I (S9430) 必须稀释1,000倍(1/1000)并且每个75 µl SeqPlex扩增反应仅使用1µl稀释液。除S9430外,其他SYBRGreen配方未经过测试,不推荐使用。

在扩增“平台期”开始后至少2-3个循环时,可达到最佳效果,如图1所示。最佳扩增循环数取决于起始DNA模板的数量和质量。

如果扩增反应不添加SYBRGreen I,使用0.1-1.0 ng高质量DNA通常可在18-24个循环获得良好结果。低质量DNA可能需要更高的起始量和/或更多的循环。如果起始量接近
10 pg,则可能需要多达29个循环才能到达扩增平台期。

注意:如果达到平台期需要的循环数超过29个,则后续的NGS结果可能会不符合要求。请查看故障排除指南。

qPCR 幻灯片

10.充分混匀,并按以下设置在实时荧光定量热循环仪中运行:

初始变性:94 °C,2分钟
循环至平台期开始后的2-3个循环:
    94 °C变性15秒
70 °C退火/延伸5分钟
(读取荧光值)
循环后:
    70 °C,30分钟
4 °C,保温

注意:循环后在70°C的延伸孵育对于有效去除引物至关重要。

反应物可立即纯化或先保存在–20 °C。

11.使用GenElute PCR Clean-Up Kit (NA1020)进行纯化。使用50 µL无核酸酶的水进行洗脱。

12.通过测量260nm处的吸光度,测定纯化DNA的浓度。每A260单位等同于50ng/uL DNA。在该点的得率取决于起始DNA的质量,但通常在1-5 µg范围内。

注意:其他测量技术,如PicoGreen®,通常会低估实际SeqPlex DNA得率。

此时,SeqPlex DNA适用于qPCR和基因芯片。为进行深度测序,建议去除SeqPlex引物。

可选: 可通过凝胶电泳或毛细管电泳评估扩增质量。一般情况下,毛细管芯片需要1µL的粗扩增产物或纯化扩增产物,如Agilent生物分析仪,而琼脂糖凝胶电泳通常需要5 µL。

引物去除

注意—GenomePlex WGA资深用户:

SeqPlex增强型(SEQXE) 引物去除试剂不适用于采用上一代SeqPlex (SEQX)或GenomePlex (WGA1-5)扩增获得的DNA。
为获得足以满足大部分深度测序工作流程需要的产物量(>1μg),建议的反应起始量为2.1 μg。

13.在冰上完成以下试剂添加步骤:
    8.0 µL - 10x 引物去除缓冲液 (SR401)
    1.6 µL - 引物去除溶液 (SR400)
    X µL – 2.1 μg 纯化 SeqPlex DNA
    Y µL - 水 (W4502)
    --------------------------------------------------
    76.25 µL 总反应体积

14混匀。如果要进行可选的引物去除测定(参见附录1),则取出5 µL 置于独立试管中,作为“无引物去除酶”对照。

15向第13步剩余的71.25 µL反应液中加入3.75 µL引物去除酶(SR402)。

16按以下设置,孵育有酶和无酶反应:
    37 °C,60分钟
65 °C,20分钟
4 °C,保温

17从热循环仪中取出反应物,短暂离心并混匀。反应物可在–20 °C保存最多3天,也可立即纯化。

18如果要进行可选的引物去除测定,则在纯化前从“有引物去除酶”反应物中取出5 µL并保存(参见附录1)。

19按之前第10步所述方法,使用GenElute PCR Clean-up Kit的引物去除酶纯化剩余的反应物。

测序

SeqPlex DNA现在可立即用于下一代测序工作流程,包括末端制备,但通常不需要片段化或大小筛选。大部分SeqPlex DNA的长度介于200-500个碱基对之间。尽管通常没有必要,但可通过物理或酶解方法进行额外的片段化处理。

去除引物后,每个SeqPlex扩增子末端将具有一个5’-磷酸和一个2-碱基的3 '-突出端。在进行测序引物连接之前,采用T4聚合酶对双链片段的两端进行修复。

在引物去除处理后,任何保留引物的SeqPlex扩增子将具有一个5 ' -羟基。无需T4 DNA激酶处理,并且其缺失将减少测序引物与任何残留的未消化SeqPlex引物的连接。

Illumina工作流程中的3 ' -腺苷酸化在很大程度上阻止了连接产物的出现,如嵌合体。嵌合体已被报道出现于Roche 454文库制备和测序中。对于ABI SoLID测序,测序前的二次筛分步骤可能有助于减少嵌合体或串联体。

产物分析

该试剂盒已被证明可用于扩增ChIP DNA样品和全基因组片段化DNA模板。请注意,高复杂度DNA样品(如ChIP输入DNA)与低复杂度DNA样品(如ChIPed DNA)中的相同序列可能具有不同的扩增程度。因此,最好以复杂度相近的样品进行扩增程度比较,如来自经处理和未处理细胞或肿瘤和正常组织的ChIPed DNA。
SeqPlex DNA已成功用于为采用标准Illumina工作流程方案的Illumina GAIIx和MiSeq制备测序样品,包括:末端制备、精修、扩增和大小筛选。
在将样品用于下一代测序前,我们强烈建议在引物去除后使用已知存在于起始DNA中的短(<300bp)DNA序列的引物进行PCR,以确认SeqPlex DNA的质量。

注意:含有5’-CTGAAG-3’或5’-CTTCAG-3’序列的PCR产物或引物在去除引物后不会扩增。

在去除引物后不会扩增的PCR产物实例:

引物去除

在引物去除之前或之后,SeqPlex DNA中的特定靶点也可通过PCR或基因芯片来确认。

SeqPlex DNA的稳定性与在相同条件下储存的基因组DNA相当。

附录1

可选: 引物去除检测
使用5X扩增混合液(A5112)、SeqPlex DNA聚合酶(SP300)和5 µL来自上述第18和14步的“有”和“无引物去除酶”剩余样品,通过qPCR评估引物去除效率。试剂盒提供的5X扩增混合液和DNA聚合酶足以用于每个扩增反应中“有”和“无引物去除酶”样品的引物去除检测。

  1. 将“有”和“无引物去除酶”样品连续稀释1,000,000倍(如,将1 µL样品稀释于99 µL水中,连续稀释3次)。

  2. 为上述两个样品制备检测混合液
        6.6 µL 5X 扩增混合液 (A5112)
        0.33 µL SeqPlex DNA聚合酶 (SP300)
        0.33 µL SYBR Green (S9430) 的1/1,000稀释液,稀释剂为水
        3.75 µL 水 (W4502)

    注:每次检测需求体积较小的试剂可以在添加前用水稀释,以避免测量不准确,或者可以为多次检测制备测定预混液。

  3. 取1,000,000倍稀释的SeqPlex“有”和“无”酶样品各10 µL,分别置于独立的PCR管或孔中。

  4. 向第3步的两份10 µL1,000,000倍稀释SeqPlex产物中分别加入5 µL来自第2步的测定混合液。

  5. 按以下设置进行扩增:
        94 ºC,2分钟。
        30 - 35个循环*
            94° C,15 秒
            70° C,5分钟(读取)

如果在至少4个循环时,“有”引物去除酶反应的Ct/Cq值大于“无”酶反应的Ct/Cq值,表明引物去除成功。

参考文献

1.
Lo R, Matthews J. 2012. High-Resolution Genome-wide Mapping of AHR and ARNT Binding Sites by ChIP-Seq. 130(2):349-361. https://doi.org/10.1093/toxsci/kfs253

故障排除指南

常问问题解答

  1. SeqPlex DNA是否可用于基因芯片和qPCR?可以,有或无引物去除的SeqPlex DNA均可用于这些应用,如基因组DNA或现有的GenomePlex产品。

  2. 如果不需要去除引物,那么SeqPlex比GenomePlex还有哪些优势?SeqPlex预扩增引物比现有GenomePlex WGA引物的靶向性更强,因此对于某些区域具有更高的基因组覆盖度,这是它的优势。

  3. 减少扩增过程的循环数是否能改善结果?不能,在“平台期”后至少运行2-3个循环,可达到最佳效果。循环不足将导致效果/覆盖度显著降低。

  4. 如果无法通过实时荧光定量PCR监测扩增循环,那么应该运行多少个循环?当无法通过监测确定最佳循环条件时,建议进行过度循环。对于100 pg-1 ng ChIP样品,24个循环是足够的。对于小于100 pg或质量较差的输入样品,29个循环是足够的。

  5. 去除引物后剩余的SeqPlex引物是否会干扰下一代测序仪簇检出?不会,含有极少量残余引物的SeqPlex DNA将在Illumina GAIIx和MiSeq仪器上产生优质的序列。为获得最佳的SeqPlex DNA簇检出,请参阅“NGS IVC异常”的故障排除指南。

  6. SeqPlex引物去除酶是否会去除全部SeqPlex引物?会,SeqPlex引物去除酶可去除完整的引物,但消化可能不是100%完成。

  7. SeqPlex引物的所有拷贝是否会被完全去除?可能会残留少量的完整SeqPlex引物。大部分SeqPlex DNA(>90%)将完全去除SeqPlex引物。

  8. 预期得率是多少?得率波动范围很大,取决于多种因素。以100 pg of ChIP DNA为起始物料,预计每个引物去除反应可获得约1-5 ug扩增产物和1-3 µg 可立即用于NGS文库制备的SeqPlex DNA。
    注意:预计引物去除将减少多达50%的产物。因此,如果测序需求量大于1 μg,则应进行多次独立的2 μg引物去除反应。

  9. GenomePlex扩增试剂盒 (WGA3) 是否可与SeqPlex一起使用?不可以,引物去除前后的SeqPlex DNA与GenomePlex再扩增试剂盒不兼容。其引物序列不同。

  10. SeqPlex DNA是否需要特殊的NGS测序方案?不需要,SeqPlex DNA可直接用于NGS工作流程,就像ChIP DNA一样。应告知测序仪操作人员直接运行SeqPlex DNA,并预期IVC图中将出现残留引物的微弱信号。
材料
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