GenElute™细菌基因组DNA试剂盒实验方案
（NA2100、NA2110、NA2120）

GenElute™细菌基因组DNA试剂盒描述

我们的GenElute™细菌基因组DNA试剂盒提供了一种从各种培养细菌中分离纯DNA的简便方法。该试剂盒包含从革兰氏阴性细菌中分离和纯化基因组DNA所需的所有试剂。对于大多数革兰氏阳性细菌，该试剂盒必须与选购的溶菌酶（L4919）一起使用，以有效裂解厚的肽聚糖细胞壁。为了方便制备溶菌酶原液，我们提供了一种稀释的革兰氏阳性裂解溶液。

GenElute™试剂盒将硅胶膜系统的优势与微量离心形式结合在一起，同时无需采用昂贵的树脂、乙醇沉淀、以及诸如苯酚和氯仿等有害有机化合物。细菌首先在含有高离液盐的溶液中裂解，以确保大分子彻底变性。之后加入乙醇，当裂解物在微量离心管中离心到硅胶膜上时，DNA结合到膜上。在洗涤去除污染物后，将DNA在200 μL的Tris-EDTA溶液中洗脱。

预期的基因组DNA得率取决于细菌培养物的细胞密度、细菌种属以及所用的菌株。附录2列出了从一些革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌中纯化的基因组DNA的典型得率。经GenElute™试剂盒纯化的 DNA 的A₂₆₀/A₂₈₀比值在1.6和1.9之间，长度可达50 kb。所得DNA可以用于各类下游应用，包括限制性核酸内切酶消化、PCR和南方印迹。

需要但未提供的仪器和试剂

• 37°C水浴或加热块
• 55°C水浴或加热块
• 移液器吸头（建议使用气溶胶阻隔）
• 1.5 mL微量离心管，用于裂解
• 微量离心机（2 mL管，装有转子）*
• 乙醇（95％-100％），货号E7023, E7148, 或 459836
• 分子生物学试剂水，货号W4502
• 溶菌酶，货号L4919（仅用于革兰氏阳性）
• 变溶菌素，货号M9901（仅用于链球菌）
• 溶葡球菌酶，货号L7386（仅用于葡萄球菌）

注意：为了确保所有试剂管的正确放置，建议使用 24 位转子。如果您使用的是36位转子，我们建议每隔一个位置放一个管。

储存方法和稳定性

室温储存试剂盒。如果任何试剂盒试剂形成沉淀物，请以 55–65°C 温热，直到沉淀物溶解，并在使用前冷却至室温。

制备说明

1. 将水浴或加热块预热至55 °C
   适用于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。  
   
   
2. 将水浴或加热块预热至37 °C
   仅适用于革兰氏阳性菌。
    
3. 彻底混合试剂
   检查试剂是否有沉淀。如果试剂盒的任何试剂发生沉淀，加热至55-65°C，直至沉淀物溶解，然后在使用前冷却至室温。
    
   
4. 稀释洗液浓缩液
   用 10 mL（10 份制备包）、80 mL（70 份制备包）或 360 mL（350 份制备包）95-100%乙醇稀释浓缩液。每次使用后，盖紧稀释的清洗液，以防乙醇蒸发。
    
5. 重构蛋白酶K
   根据表1，将一瓶蛋白酶K干粉溶于水，得到20 mg/mL原液。蛋白酶K溶液可在2-8℃下保存数天。若要保存更长时间，溶液中未使用的部分
   可在–20°C条件下等分保存至需要之时。所提供的原样产品在室温下稳定。
   
   注意：每次必须将蛋白酶K溶液直接添加到每个样品中。请勿将蛋白酶K溶液与裂解液混合保存。

6.  制备溶菌酶溶液（仅适用于革兰氏阳性菌）
   使用所包含的革兰氏阳性裂解液(L7539)作为稀释剂，制备2.115 × 106单位/mL溶菌酶(L4919)原液（约45 mg/mL）。例如，如要制备1 mL溶菌酶溶液，将2.115 × 106单位的溶菌酶溶解在1 mL革兰氏阳性裂解液中。
   
   上下吸移混合物或涡旋，以溶解溶菌酶（参见下面的注释）。对于要进行的每种DNA制备，需要200 μL溶菌酶溶液。需要多制备一些溶液，以弥补移液错误。  溶菌酶溶液应在制备后当天用完。
   
   注意：溶菌酶可以通过上下吸移混合物而不是涡旋更容易溶解。过度涡旋容易起泡。这可造成溶菌酶不易溶解，在这种情况下，不需要在使用前使其完全溶解。基因组DNA得率不会受影响，因为溶菌酶在37°C下孵育期间会溶解。

操作流程

如果在下游应用中需要最小剪切基因组 DNA，例如，如果使用最终产物进行长扩增 PCR，则通过温和移液或倒置混合至均匀，而不是在随后的程序中振荡。附录1列出了g-力至RPM的转换。

A. 革兰氏阴性细菌的制备

1a.收获细胞
12,000-16,000 ×g离心2分钟，以沉淀1.5 mL过夜细菌肉汤培养物。完全去除培养基并丢弃。
注意：如果细菌在富含营养的培养基如极品肉汤(T9179)中繁殖，则须将起始材料的体积减少至0.5 mL过夜细菌肉汤培养物，以免使GenElute™柱过载。有关更多信息，请参见附录2。

2a.重悬细胞
将沉淀重悬于180 μL裂解液T或者GenElute™哺乳动物基因组DNA试剂盒（B6678）的缓冲液STL中。如果不担心残留RNA，则直接前往执行步骤3a。
可选的RNase处理：如果需要无RNA的基因组DNA，则加入20 μL RNase A溶液 (R6148)，混合并在室温下孵育2分钟，然后前往执行步骤3a。

3a.准备裂解细胞
向样品中加入20 μL蛋白酶K溶液。混合并在55℃下孵育30分钟。

4a.裂解细胞
加入200 μL裂解液C（B8803），彻底涡旋（约15秒），并在55 ℃下孵育10分钟。
均匀的混合物对于高效裂解是必不可少的。
继续步骤 5。

B. 革兰氏阳性细菌的制备

1b.使用鸡蛋白溶菌酶制备溶菌酶溶液(L4919)
按照制备说明，制备2.115× 106单位/mL溶菌酶原液。对于要进行的每种DNA制备，需要200 μL溶菌酶溶液。需要多制备一些溶液，以弥补移液错误。
注意：注意：如果用的是葡萄球菌，则用200单位/mL溶葡球菌酶(L7386)补充溶菌酶溶液。对于链球菌，则用250单位/mL变溶菌素(M9901)补充溶菌酶溶液。

2b.收获细胞
12,000-16,000 × g离心2分钟，以沉淀1.5 mL过夜细菌肉汤培养物。完全去除培养基并丢弃。
注意：如果细菌在富含营养的培养基如极品肉汤（T9179）中繁殖，则须将起始材料的体积减少至0.5 mL过夜细菌肉汤培养物，以免使GenElute™柱过载。有关更多信息，请参见附录2。

3b.重悬细胞
将沉淀重悬于200 μL溶菌酶溶液（步骤1b中制备）中，并在37 ℃下孵育30分钟。
可选的RNase A处理：如果不用担心残留RNA，可继续步骤4b。如果需要无RNA的基因组DNA，则加入20 μL RNase A溶液，在室温下孵育2分钟，然后前往执行步骤4b。

4b.裂解细胞
向样品中加入20 μL蛋白酶K溶液，然后加入200 μL裂解液C（B8803）。彻底涡旋（约15秒），并在55℃下孵育10分钟。均匀的混合物对于高效裂解是必不可少的。继续步骤 5。

从革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中分离DNA
这是在步骤1-4a和/或步骤1-4b中制备了裂解物之后的后续操作。

5.准备色谱柱
在每个预组装的GenElute™ Miniprep结合柱（带有红色O形环，不要与其他GenElute™试剂盒混淆）中加入500 μL柱准备液，置于2 mL收集管中。12,000 × g离心1分钟。丢弃洗脱液。
注意：柱制备溶液可最大限度地提高DNA与膜的结合，从而获得更稳定的产量。

6.准备结合
向裂解物中加入200 μL乙醇（95-100％），并涡旋5-10秒充分混合。确保混合均匀。

7.加载裂解物
将管中的全部内容物转移到结合柱中。在将内容物转移到色谱柱中时，使用广口移液器吸头，以减少对DNA的剪切。≥ 6500 × g离心1分钟。丢弃含有洗脱液的收集管，并将柱置于新的2 mL收集管中。

8.第一次洗涤
向柱中加入500 μL洗涤液液（W0263），并以≥6500 x g的转速离心1分钟。弃去含有流通液的收集管，将吸附柱置于新的2 mL收集管中。

9.第二次洗涤（重要提示：确保洗涤溶液浓缩液中已加入乙醇。）
向柱中加入500 μL洗涤液，并以最大速度（12,000-16,000 × g）离心3分钟以干燥吸附柱。在洗脱DNA之前，柱中不得含有乙醇。
如果看到有乙醇残留，则以最大速度将柱额外离心1分钟。如果您需要此额外的离心步骤，您可以清空并重新使用采集管。最后，丢弃含有洗脱液的收集管，并将柱置于新的2 mL收集管中。

10.洗脱DNA
移取200 μL洗脱液（B6803）直接到柱中心，以≥ 6500 × g离心1分钟以洗脱DNA。为了提高洗脱效率，在加入洗脱液后在室温下孵育5分钟，然后离心。
可选: 重复步骤10进行第二次洗脱，用另外的200 μL洗脱液，洗脱到新的2 mL收集管，或洗脱到第一洗脱所使用的2 mL收集管中。通过进行第二次洗脱，得率可提高20-50％。

洗脱液含有纯基因组DNA。DNA可短期储存于2-8°C下。
如要长期保存，建议储存于-20°C下。避免冻融，以免引起DNA链断裂。洗脱液将有助于在这些温度下稳定 DNA。

结果

基因组DNA的浓度和质量可通过分光光度分析和琼脂糖凝胶电泳确定。在TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0-8.5）中稀释DNA，使用石英微量比色皿测量260 nm、280 nm和320 nm处的吸光度。260 nm和280 nm处的吸光度应介于0.1与1.0之间（或在分光光度计的线性范围内）。320 nm吸光度用于校正背景吸光度。260 nm处的吸光度1.0对应于约50 μg/mL双链DNA。A260–A320/A280–A320比例应为1.6-1.9。
DNA的尺寸和质量可以通过琼脂糖凝胶电泳法来确定。¹ 含有 0.8%琼脂糖的凝胶 (A9539) 置于0.5X TBE缓冲液 (T6400) 中对于基因组DNA的解析效果非常好。溴化乙锭 (E1510)之类的嵌入染料可用来观察DNA，并对比已知的DNA标记物，例如λ-DNA Hind Ⅲ消化物 (D9780)，进行测量。基因组DNA应作为单一的高分子量条带迁移，几乎没有剪切迹象。脉冲场凝胶电泳法可以
更精确地测定DNA的尺寸。²

故障排除

附录1

注意：所有转速都是以g为单位的。有关将g-力转换为RPM的信息，请参阅表2。如果没有所需g力的离心机 / 转子，请尽可能使用最大g力，并按比例增加离心时间。离心直至所有液体通过色谱柱。

有关所选常用离心机和转子的转速（RPM），请参见上表。可以使用以下公式计算未列出的转子的正确RPM：

式中：RCF = 所需的重力加速度（相对离心力），单位为g；
r = 转子半径，单位为cm；
RPM = 达到所需g力所需的每分钟转数

附录2   

注意事项和免责声明

GenElute™细菌基因组DNA试剂盒仅供研发使用，不适用于药物、家庭或其他用途。有关危险和安全处理方法的信息，请参阅安全数据说明书。

GenElute是Sigma-Aldrich Co. LLC的商标。