mRNA疫苗与治疗药物的生产策略

mRNA 生产需考虑的因素

mRNA疫苗和治疗药物的生产通常遵循一种模板化流程（图1）。这种简化的生产模板针对任何靶标均使用相同的反应原料，使mRNA制造商能够通过最少的工艺调整来生产新的靶标分子。

若干关键决策对最终mRNA产品的工艺流程、收率和质量具有重大影响，其中之一便是工艺化学品和原材料的质量。特别是在体外转录和下游纯化过程中，mRNA处于无保护状态，面临较高的酶降解风险。使用经过内切核酸酶活性检测的高质量化学品，可最大限度地降低由核糖核酸酶（RNase）引起的降解风险，并提高mRNA在整个纯化及mRNA药物制剂制备过程中的稳定性。

本网页将通过介绍我们旨在优化 mRNA 生产的全面、集成化解决方案，助您应对这些及其他挑战。我们的宣传册《mRNA 药物生产用工艺化学品》提供了您做出明智选择所需的详细信息。

mRNA：结构元件及其功能

mRNA构建体的设计旨在确保目标基因的高效表达。其稳定性、基因表达以及高效的蛋白质翻译取决于若干结构元件（图2）：

• 序列5’端的Cap区：对mRNA成熟、被核糖体识别以实现高效的蛋白质翻译，以及防止核酸酶降解以提高稳定性至关重要。
• mRNA编码区上游和下游的未翻译区（UTRs）：调控mRNA的翻译、定位和稳定性；可用于提高蛋白质表达效率。
• 开放阅读框或编码序列区域：包含目标基因（GOI）。
• 多聚腺苷酸（poly(A)）尾：通过防止3’外切酶的降解，对蛋白质翻译和mRNA稳定性至关重要。

mRNA的制备

基于mRNA的治疗药物和疫苗的生产始于质粒DNA（pDNA）模板，该模板随后被线性化并转录成mRNA。

• 质粒DNA制备：质粒DNA模板包含DNA依赖性RNA聚合酶启动子以及mRNA构建体的序列。质粒DNA在细菌细胞内扩增，随后收集并裂解细胞以释放环状质粒DNA。该裂解液粘度极高，因为其中不仅含有质粒DNA，还含有其他大分子负电荷杂质，如RNA、基因组DNA以及来自细菌细胞的内毒素，这使得纯化过程充满挑战。
• pDNA纯化：从杂质中纯化pDNA模板时，应最大限度地实现分离，同时尽量减少对质粒模板的机械损伤。 随后，将纯化的环状pDNA线性化，以避免转录穿透事件——该现象可能产生需要去除的非预期mRNA序列变体。^¹ 该线性化pDNA模板需进一步纯化，以去除用于线性化的限制性内切酶、牛血清白蛋白（BSA）、DNA片段及内毒素等杂质。 由于 pDNA 模板通常在细菌细胞中产生，内毒素杂质是影响后续纯化步骤的关键杂质。Deviron^® C16 等洗涤剂可有效去除内毒素，且作为传统洗涤剂的替代品，具有可持续、可生物降解且符合 REACH 法规的特性。²

实验室规模与GMP生产规模在pDNA纯化方法上存在显著差异。实验室规模的工艺通常采用溶剂萃取技术将pDNA与其他组分分离，但在大规模生产中，这些化学品的处理和处置可能面临挑战。相比之下，GMP生产环境通常采用切向流过滤（TFF）和色谱法来高效去除杂质。 

体外转录（IVT）：经线性化和纯化的pDNA随后通过酶促反应转录为mRNA。

• 体外转录的关键组分包括：催化DNA转录为mRNA的RNA聚合酶；作为mRNA构建模块的核苷三磷酸（rNTPs）；可提高mRNA产量的无机焦磷酸酶（IPP）；以及防止RNA降解的核糖核酸酶抑制剂。 转录缓冲液通常含有二硫苏糖醇（DTT），用于还原二硫键并抑制核糖核酸酶活性；同时加入精胺以提高转录效率并稳定核酸。为最大限度降低此关键工艺步骤中酶促降解的风险，必须选择经过测试且不含内切核酸酶活性的化学品。 如需全面了解我们的高品质化学品和辅料（包括广泛的无内切酶产品组合），请查阅我们的宣传册《mRNA药物生产用工艺化学品》。
• 转录监测：在体外转录（IVT）反应过程中，应监测关键工艺参数（CPPs），以控制关键质量属性（CQAs）并确保最佳工艺流程。有效的监测可实现更受控的生产，并能更快地应对工艺波动。 

加帽：转录完成后，需在mRNA转录本上添加5’帽结构，以提高其在宿主细胞中的稳定性和转导效率。加帽可通过两种方式实现：

• 转录共封帽：在IVT步骤中进行。但该方法效率和收率较低，且可能因结合错误或反向整合而产生未封帽杂质。
• 酶促加帽（或称翻译后加帽）在mRNA纯化后进行。该方法通常使用加帽酶将帽结构添加至纯化的mRNA上。虽然该方法效率更高，但成本更高，且是纯化后的额外处理步骤。

mRNA的纯化

体外转录完成后，需对mRNA进行纯化，以去除前几步操作中产生的杂质和残留物，包括内毒素、具有免疫原性的双链RNA（dsRNA）、残留DNA模板、RNA聚合酶以及元素杂质。目前有多种方法可用于mRNA的纯化和残留DNA的去除。

色谱分离方法（如反相离子对色谱（IPRP）、阴离子交换色谱（AEX）以及利用聚（dT）捕获的亲和色谱（AC）（图3））能够高效纯化目标mRNA并去除DNA模板，从而无需进行DNA^{消化1, 3}。在酶促加帽反应后，也会使用色谱法去除不需要的mRNA转录本和寡核苷酸杂质。

• 反相离子配对色谱（IPRP）可在小规模应用中高效捕获目标单链RNA（ssRNA）并将其与杂质分离。然而，由于该方法需要使用溶剂，因此不太适合GMP生产，且更适用于纯化而非捕获。
• 阴离子交换（AEX）色谱具有较高的动态结合容量，可高效去除双链RNA（dsRNA）、无帽RNA、RNA-DNA杂合体以及发夹mRNA等其他RNA结构。虽然AEX使用水溶液，但需要使用潜在有毒的变性剂，且操作温度需高达85 °C才能脱附结合在树脂上的大分子mRNA。
• 亲和色谱（AC）聚(dT)捕获法利用树脂特异性捕获全长mRNA转录本的聚(A)尾。该方法可高效去除DNA、核苷酸、酶、缓冲液组分以及任何不具有聚(A)尾的杂质。因此，AC通常用于初始mRNA捕获，随后采用AEX进行纯化。
• 色谱步骤完成后进行最终浓缩和透析，以最大限度提高产物纯度，并将mRNA转移至适用于制剂或储存的缓冲液中。

规模化生产注意事项

对于拥有大量目标产品管线的制造商而言，一次性技术具备可扩展性、适应性和质量保障，是许多mRNA GMP生产工艺的关键推动力。GMP生产利用TFF或色谱步骤的优势进行高效的大规模分离，取代了小规模工艺开发中常见的替代性纯化方法。需注意的考虑因素包括：

• TFF 或色谱步骤取代了 mRNA 工艺开发中常用的溶剂萃取和沉淀步骤。
• 应尽可能使用高品质化学品和无内切酶试剂，以提高mRNA稳定性并最大限度降低mRNA降解的可能性。

近年来，mRNA疫苗在面向广大患者群体的推广方面取得了重大成功。尽管仍面临挑战，但通过使用高品质化学品和无内切酶试剂来最大限度提高mRNA稳定性，以及优化和定制色谱纯化技术以实现最佳分离并简化规模放大，这些举措已使GMP生产模板取得了重大进展。  

为了充分发挥mRNA技术的潜力，我们需要借助创新的解决方案、专业技术知识和独到见解，确保在生产规模上构建稳健的平台。凭借我们的产品、服务和技术专长，我们致力于开发一体化解决方案，以优化您的mRNA生产流程。