mRNA疫苗和治疗制剂生产策略

新冠疫苗的快速成功开发证明了 mRNA 的强大威力，但其潜力远不止于此： mRNA 技术针对诸多尚未满足的医疗需求拥有广阔的应用前景，并可为抗击癌症、心脏病或传染病提供新的治疗方案。 

将mRNA递送到患者细胞的细胞质中可诱导产生靶向蛋白。它可以发挥治疗性或预防性作用，比如作为抗原刺激机体产生免疫反应获得免疫保护，替代有缺陷的蛋白功能或激活抗肿瘤反应。

与广泛应用于疫苗和基因疗法的腺相关病毒（AAV）载体等病毒递送系统相比，mRNA 技术等非病毒递送系统具有多种优势：安全性更高，功能性更强，并可使用模板化工艺来简化生产流程。研发科学家致力于通过优化流程和递送平台来提高 mRNA 的稳定性、翻译效率和安全性。

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• mRNA 生产注意事项
• mRNA：结构要素及其功能
• 制备 mRNA
• 纯化 mRNA
• 配制 mRNA
• 工艺放大注意事项
• mRNA：前景可期
• 相关产品

mRNA生产注意事项

mRNA 疫苗和疗法 的开发和生产相对简单、可放大且极为迅速（图 1）。mRNA技术缩短了从开发到临床和获批的进程，不仅有助于快速有效地应对爆发性传染病，也适合用于开发满足治疗需求的新疗法。

mRNA 通过 体外 酶法加工合成。与传统 体内 蛋白表达相比，无需耗时的克隆和扩增步骤，也无需去除细胞和宿主细胞蛋白。这种简化的生产工艺具有出色的速度和灵活性，它可以使用相同的反应材料和容器生产任一靶标，使GMP设施仅需对工艺和配方稍作调整，即可迅速转向新的蛋白质靶标生产。

要优化工艺、产量、质量和最终产品的安全性，需考虑几个关键因素。例如，需要选择合适的工艺化学品和原材料。尤其是在 体外 转录和下游纯化过程中，mRNA 未被保护，很有可能被酶降解。使用经过 无核酸内切酶活性 检测的产品 ，可降低mRNA 在制备、纯化到配制的整个过程中由RNase引起的降解风险。为了控制微生物和内毒素污染的风险，使用微生物和内毒素含量较低的产品也很重要。对于注射剂等高风险应用 ，这一点尤为关键，因为在此类应用中微生物污染造成危害的可能性更大。

本网页专门介绍 mRNA，并提供有关技术和产品选择的深入信息，帮助您轻松自如地掌控从生产到最终灌装 mRNA的整个过程。为了帮助您做出明智的决定，我们在宣传册 "所有 mRNA 平台的赋能能力和解决方案" 和 "用于 mRNA 药物生产的工艺化学品" 中提供了有关产品、服务和专业知识的详细信息。

mRNA结构要素及其功能

mRNA的结构设计要保证目的基因的高效表达。稳定性、基因表达和高效的蛋白翻译受多个结构要素影响（图2）：

• 序列 5' 端的帽子结构：对于 mRNA 的成熟、核糖体的识别（用于实现高效的蛋白质翻译）以及防止核酸酶消化（可提高稳定性）至关重要。
• 位于 mRNA 编码区上游和下游的非翻译区 (UTR)：调节 mRNA 的翻译、定位和稳定性；可用于提高蛋白质的表达效率。
• 开放阅读框或编码序列区：包含感兴趣的基因 (GOI)。
• Poly（A）尾：通过防止 3' 外切酶的消化，对蛋白质翻译和 mRNA 稳定性至关重要。

制备mRNA

基于 mRNA 的疗法和疫苗的生产 如图 1 所示，首先以质粒 DNA (pDNA) 为模板，然后将其线性化并转录成 RNA：

• pDNA 生产：pDNA 模板包含 DNA 依赖性 RNA 聚合酶启动子和 mRNA 构建的相应序列。鉴于DNA模板在mRNA疫苗生产中的核心作用，其设计和纯度是优化mRNA产品的重要因素。符合要求的pDNA在细菌细胞内（通常为大肠杆菌）扩增建库，接着纯化得到浓缩的环状纯pDNA。在我们的出版物 "设计质粒 DNA 下游纯化工艺"中，我们深入探讨了如何克服与核酸的大尺寸和高粘度、剪切敏感性以及 pDNA 和杂质之间相似性有关的挑战。

• pDNA 线性化在反应缓冲液¹ 中使用限制酶对环状 pDNA 进行线性化，作为 RNA 聚合酶转录所需 mRNA 的模板。线性化是为了防止转录通读生成非必要的mRNA，成为需要去除的杂质。

• pDNA纯化: 去除限制性酶、牛血清白蛋白（BSA）、DNA片段、内毒素等杂质。大多数实验室规模的工艺都采用溶剂萃取技术，但这种技术并不适合 GMP 生产环境。作为替代，可改用切向流过滤(TFF)和色谱技术高效去除杂质。内毒素已被确定为 pDNA 生产过程中的关键杂质，对后续工艺步骤和最终的患者安全都有很大影响。洗涤剂可用于去除内毒素，例如使用 Deviron^® C16 洗涤剂作为传统洗涤剂的一种合适的可持续、可生物降解和符合 REACH 法规的替代品。²

有关pDNA 生产和纯化的更多信息，请参阅我们的专门技术文章 。

• 体外 转录（IVT）：线性化的 pDNA 作为 DNA 模板，在酶促反应中利用自然转录过程的元素转录成 mRNA。体外 转录的关键成分包括将 DNA 序列转录为 RNA 序列的 RNA 聚合酶、作为 mRNA 构建单元的核苷三磷酸酯（NTP）、提高 mRNA 产量的无机焦磷酸酶（IPP）以及防止 RNA 降解的 RNase 抑制剂。在转录缓冲液中，通常会加入二硫苏糖醇（DTT，一种二硫键还原剂，可抑制 RNase 的活性，从而提高 mRNA 的稳定性）和亚精胺（一种可提高转录效率和核酸稳定性的成分）等化学物质。
  拉曼作为一种强大的分析工具，可用于监测酶促反应，如 IVT 步骤。迄今为止，对 IVT 步骤的监控都是通过乏味的离线分析来完成的，这样就无法在反应条件和/或生产率未达到目标时立即采取行动。这个问题可以通过拉曼光谱来解决，拉曼光谱可以更快地测量 CPP 和 CQAs，使操作人员能够更快地做出决定，确保最佳工艺条件。

• 加帽：转录后，未成熟mRNA需要在5’端加帽，以加强其在细胞中的稳定性和转导效率。帽子结构可以通过两种方式添加，一种是共转录方式，另一种是通过两步酶解过程在转录后添加。
  共转录加帽通常将帽类似物和鸟苷三磷酸(GTP)按4：1的比例添加到转录混合物中。共转录加帽与转录同时进行，使用相同的反应混合液，因此相比酶法加帽更加便宜和快速。不过，这种方法的效率和产量较低，而且会因错误结合或反向掺入而产生非封端杂质。为了解决这一问题，研发了一些抗反向帽类似物(ARCA)，用于防止5’帽的反向加入，使翻译效率更高。
  从体外 转录混合物中纯化出 mRNA 后，进行酶封顶（或翻译后封顶）。通常采用痘苗病毒加帽酶在mRNA结构上加帽。虽然酶法加帽效率更高，但更为昂贵，并且多一步操作。

这些工艺步骤之后是 mRNA 的纯化和配制，以获得最终的药物产品。

mRNA纯化

完成体外转录之后, 将所得mRNA从上一步骤中的杂质和所用材料中纯化出来。这些杂质和材料包括内毒素、免疫原性双链RNA(dsRNA)、残留DNA模板、RNA聚合酶和元素杂质。在这一阶段，需要采用适合TFF、酶法加帽和/或色谱分离的缓冲液。mRNA 纯化 和去除残留 DNA 有多种方法可选：

• 切向流过滤（TFF） ，用于从膜无法截留的较小杂质中有效分离 mRNA。通常情况下，DNA 模板会通过添加脱氧核糖核酸酶被降解；随后产生的小 DNA 片段可通过 TFF 从较大的 mRNA 分子中轻松分离出来。根据 mRNA 的大小，可使用截留分子量范围为 30 至 300 kDa 的TFF。TFF技术方便我们在相同的单元操作中进行产品的纯化、浓缩和洗滤。然而，小的 DNA 片段会与 mRNA 杂交，产生额外的杂质，如果使用捕获去除 DNA 模板，就可以避免这种情况。³ 


• 色谱技术 ，如反相离子对（IPPR）、阴离子交换（AEX）和使用聚（dT）捕获的亲和层析（AC）（图 3），提供了去除 DNA 模板的有效方法，消除了 DNA 模板消化的需要和在超滤/渗滤步骤中可能发生的杂交风险。¹ 为了去除不需要的产物和寡核苷酸杂质，在酶封盖步骤之后还使用了色谱法。不过，这种方法成本较高，介质交换和后续步骤的制备仍然需要一个 TFF 步骤。

• 反相离子对色谱 (IPRP)常用于小规模纯化，可快速高效地纯化RNA，从DNA、双链RNA(dsRNA)和短链转录本中较好地分离单链RNA(ssRNA)。这种方法的缺点包括：溶剂的使用影响了 GMP 生产的适用性；mRNA 与离子对试剂的络合需要重过滤步骤来去除络合物；对蛋白质和聚合体污垢的敏感性使这种技术更适合精纯而非捕获。


• 阴离子交换色谱 (AEX) 的动态结合能力大于 10 mg RNA/mL，可非常有效地去除免疫原性杂质，如 dsRNA、未封端 RNA、RNA-DNA 杂交以及发夹 mRNA 等其他 RNA 结构。虽然它可使用水溶性溶液，但可能还需要添加有毒的离液盐，并要在高达85 °C的温度下操作以洗脱吸附在树脂上的mRNA大分子。环境温度下的洗脱通常适用于小于 500 个碱基的 mRNA 种类。⁵


• 亲和色谱 (AC) poly(dT)捕获法通过树脂特异性捕获mRNA全长转录的poly(A)尾。该法可高效去除DNA、核苷酸、酶、缓冲液组分等任何不含poly(A)尾的杂质。与 AEX 相同，它允许使用水溶液，AC 通常使用盐梯度。与 IPRP 和 AEX 不同的是，AC 无法区分 dsRNA 和 ssRNA，也不能有效去除其他与产品相关的杂质，如与 mRNA 杂交的 DNA 片段。因此，一种常见的方法是将 AC 用作初始层析步骤，然后再使用 AEX 进行精纯。


• 在层析步骤之后，进行最终浓缩和重滤 ，以最大限度地提高产品纯度，并将 mRNA 转移到适当的缓冲液中进行配制或储存。在这个阶段，可在相同的单元操作中进一步进行mRNA的纯化、浓缩和洗滤。 可以在 TFF 步骤之后进行无菌过滤步骤；但是，分子量为 5000 kDa 或更高的 mRNA 的无菌级过滤可能具有挑战性。

mRNA 的配方

完成最后的mRNA纯化步骤之后，下一步需要考虑的是递送机理（图4）。递送工具对确保mRNA 疫苗和疗法的有效性至关重要。最先进的给药方法之一是基于脂质和聚合物的组合，包括寡核苷酸与脂质结合形成的脂质复合物，或带正电荷的聚合物（如聚乙烯亚胺（PEI））形成的多聚物。脂质纳米颗粒（LNP）是最常用的 mRNA 运送平台。

选择脂质的注意事项

在选择脂质时，必须考虑给药途径，以确保最大的有效性和最佳的生物分布。除了脂质的选择，单个脂质之间的比例也是微调的关键，直接影响双分子层的流动性和 LNP 的融合性。在选择脂质时，有多种关键因素，包括类型、来源和质量，它们直接影响最终配方中的杂质类型和特性，如颗粒特性、稳定性和释放情况。稳定的脂质质量是获得可重复结果的必要条件，这在很大程度上取决于合成脂质所用原材料的质量和脂质的材料特性。稳定、高质量的合成脂产品搭配 由值得信赖的合作伙伴提供的量身定制的支持和服务是满足个性化需求的理想选择，可确保最终产品的最佳性能。

每种脂质纳米颗粒都包含四种不同的脂质成分，用于裹送mRNA并保护其免遭降解：

• 其中阳离子/离子化脂质用于通过静电作用包封RNA。将mRNA递送到肝细胞（用于激活或沉默蛋白表达）中需要离子化脂质（被动靶向，内体释放），而免疫细胞摄取则容易很多。强阳离子脂质也有此作用，可将 RNA 有效释放到细胞质中。阳离子脂质的结构对 LNP 的活性、毒性和生物分布有很大影响。


• 聚乙二醇(PEG)化脂质可稳定胶态，并防止蛋白吸附到纳米颗粒上，因此保护其免遭免疫系统攻击，延长血液循环时间。PEG的链长和脂肪酸链决定LNP的循环寿命和融合性（或颗粒与内体膜的融合情况）。为了延长流通时间，可以使用较长的脂肪酸链，如聚乙二醇冷酯酰甘油（DSG PEG 2000）。PEG 浓度也会影响颗粒大小。不过，使用 PEG 可能会导致抗体的形成，从而可能影响免疫效果。


• 中性/阴离子脂质可稳定颗粒结构，影响融合性和生物分布。二油酰磷脂酰乙醇胺(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine)。例如，研究表明，与 1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DSPC）相比，含有 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）的 LNPs（DOPE 在内质体释放中发挥重要作用）能增强 mRNA 向肝脏的输送。⁵ 研究结果表明，这些辅助脂质还有助于 RNA 的稳定封装。⁶


• 胆固醇用于调节LNP的脂双层密度、流动性和摄取（脂筏形成）。市售胆固醇分为动物源和人工合成两种，相较之下，合成胆固醇具有纯度更高、不含动物源分子（如朊病毒）、工艺可扩大化、高度稳定等优势。

纯化mRNA可通过不同技术包封到递送颗粒中而制成制剂。在常用的溶剂注入法中，脂质溶解在乙醇等溶剂中，通过层流混合或微流控混合与含有mRNA的低pH缓冲水溶液快速混合而成LNP。接着将低pH缓冲液洗滤成中性缓冲液，并通过超滤浓缩纳米颗粒。TFF步骤必须尽快进行，因为脂质在低pH下会水解，形成水脂(hydrolipid)等杂质，影响脂双层结构、制剂稳定性和药物释放特征。脂质降解还能增加粒径大小，导致聚集。

脂质纳米颗粒具有十分优秀的稳定性、结构可塑性，相比其他递送体系更擅长基因递送。相比裸露的mRNA，它可提高mRNA的转染率，静脉注射后不用担心mRNA会被血流中的RNA酶降解，如果加入特定的配体还能实现主动靶向。脂质纳米颗粒的劣势之一是它可能需要冷链物流。此外，某些情况下，LNP可能无法进行无菌过滤，需要考虑伽马辐照、热灭菌、高压灭菌和封闭工艺等替代方法。

如需了解有关 mRNA 制剂的更多信息，请阅读我们的白皮书 "推进脂质纳米粒子制剂临床和商业化生产的考虑因素"。

工艺放大注意事项

放大mRNA生产工艺时，有几项要点需要注意，在进行小规模的工艺开发时，应将这些要点摆在首要位置。

• 采用溶剂萃取和沉淀法的mRNA纯化步骤不易放大，并且使用的有害溶剂不适合GMP环境，可用TFF或色谱法替代。


• 由于RNA酶能在数秒内降解mRNA，所有能接触产品的原料、溶液和设备都不能含有这种酶。


• 适合的递送系统可提高疫苗或药物的效力，应仔细选择。


• 如果最终的成品是大分子mRNA复合体，应考虑产品无菌过滤的替代方法。


• 额外的供应链要求（如冷链）严重影响成本。因此，应对药物的稳定性进行仔细评估。

mRNA：前景可期

mRNA技术为新冠(COVID-19)候选疫苗研发带来前所未有的速度和出色的功效。展望未来，这项技术不仅能对疾病爆发做出快速反应，从而彻底改变疫苗开发领域，而且还有可能成为快速灵活的疫苗和疗法平台，帮助满足尚未得到满足的医疗需求。

为了充分发挥这种疗法的潜力，需要汇聚创新解决方案、专业技能和聪明才智建立简单而强大的生产规模平台。凭借我们的产品、服务和专家支持，我们致力于简化您的决策流程，帮助您成功开发 mRNA 药物产品，共同推进基于 mRNA 的疫苗和疗法的生产。