MISSION^® ;shRNA入门

为何选择shRNA？

使用对照
细菌甘油原液起始材料
纯化的质粒 DNA 起始材料
慢病毒转导颗粒起始材料
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为何选择shRNA？

RNA干扰法基因沉默和基因敲除正变得司空见惯。培养细胞引入小干扰 RNA (siRNA) 是一种快速有效的基因表达敲低方法，这也让 siRNA 迅速成为分子生物学广泛使用的工具。siRNA 经证可短期有效抑制某些转化哺乳动物细胞系中的基因，而 shRNA 则有机会有效且稳定地沉默基因表达。

长期、稳定的基因沉默让短发夹 RNA 构建体 (shRNA) 从其他 RNAi 工具区中脱颖而出。对于低周转率或可能低周转率的基因，利用shRNA进行长期沉默不仅方便，而且是唯一的选择。对于这类蛋白质，siRNA 可能会在细胞有效降解 mRNA 之前被稀释。可先采用pLKO.1 质粒标准克隆筛选方法，然后进行嘌呤霉素筛选，从而实现长期基因沉默。MISSION^®生物生产团队可提供比克隆筛选、慢病毒递送 shRNA MISSION^® TRC（何为 TRC？）更有效且偏差更小的解决方案。shRNA 慢病毒构建体可以轻松转导通常复杂的细胞系（例如原代细胞和 非分裂细胞），并将 shRNA 轻容掺入这些细胞的基因组中，实现稳定的基因沉默。

我们保证，在 shRNA 详情页面上描述的针对靶基因建立的指定数量克隆（数目不一，通常为5条克隆），至少会有一条克隆达到70%以上的靶基因敲低率。

查看我们的研发团队以及独立研究人员的应用资料。

使用对照

当使用MISSION^®TRC shRNA构建体进行实验时，选择适当对照品是您的实验设计的关键要素，以便准确解释敲低结果。所有对照品均以纯化质粒DNA和慢病毒颗粒形式提供。

此外，MISSION^® TurboGFP™对照转导颗粒(SHC003V)可在首次使用细胞系时优化转导效率。

shRNA 对照页面包含我们为所有 shRNA 实验推荐的对照，与《自然细胞生物学》社论中建议的对照严格一致。¹

细菌甘油原液起始材料

MISSION^® TRC shRNA 细菌甘油原液提供了可再生的 shRNA 构建体资源。其中的载体可直接用于瞬时或稳定转染，或与包膜质粒一起用于生成慢病毒转导颗粒。

访问载体图谱网站

MISSION^® SHRNA 细菌甘油原液技术公告 (PDF)

纯化质粒 DNA 起始材料

MISSION^®TRC shRNA纯化质粒DNA形式省去了从每个构建体制备DNA的复杂操作。DNA可直接用于瞬时或稳定转染，或与包膜质粒一起用于生成慢病毒转导颗粒。每个构建体提供1μg DNA。

访问载体图谱网站

MISSION^® SHRNA 质粒 DNA 技术公告 (PDF)

MISSION^® TRC shRNA 纯化的质粒 DNA 构建体适用于大多数市售转染试剂。某些细胞系可能比其他细胞系对转染更敏感/更耐受。可使用MISSION^® TurboGFP 对照载体 (SHC003) 优化转染效率。

我们提供了广泛的转染试剂，涵盖了多种类型的细胞。

慢病毒转导颗粒起始材料

MISSION^® TRC shRNA 慢病毒转导颗粒形式提供了极致的便利。这种转导颗粒可直接加入您的细胞。几乎所有哺乳动物细胞系都可转导，包括原代细胞和非分裂细胞。

高通量慢病毒颗粒生产结果

MISSION^® shRNA 慢病毒转导颗粒技术公告 (PDF) 

选择您所需的细胞系

MISSION^® TRC 慢病毒颗粒采用 VSV-G 包膜蛋白进行假型化，从而使含有 shRNA 的慢病毒颗粒能够有效转导到大多数哺乳动物细胞系中。首次使用细胞系时，建议使用 MISSION^®TurboGFP 对照转导颗粒 (SHC003V) 优化转导所需的慢病毒颗粒量。这一重要阳性对照可表达 TurboGFP（一种绿色荧光蛋白标记物），可用于监测实验设计并帮助解读结果。还可通过ExpressMag^®转导系统进一步增强转导。此系统组合利用纳米颗粒和强大的稀土磁体，提高慢病毒转导效率。

您的细胞系是否经过慢病毒转导验证？

选择您所需的测定方法

确定您评估靶基因表达和敲低所用的测定方法至关重要。现有多种测定方法可用来测定 mRNA 转录物水平、蛋白质水平或表型反应。选定测定方法时请谨记，必需基因敲低可能对您的细胞致命，并影响您执行的测定类型。

mRNA 转录本检测

蛋白质测定
蛋白质印迹

表型分析
癌症标志物
细胞活力和增殖
细胞信号转导

感染指数 (MOI)

感染指数是指每个细胞的转导慢病毒颗粒的数量。强烈建议对于要转导的每种新细胞类型，测试一系列MOI。通过增/减每孔的细胞数量或增/减加入孔中的上清液量，可调整MOI。这将能确定所用的每种细胞系的有效转导所需的最佳慢病毒上清液量。我们建议测试 MOI 0.5、1、2 和 5。

计算方法：

（每孔的细胞总数）x（所需的MOI）= 所需的总转导单位（TU）

（所需的总TU）/（在A的C上报告的TU/ml）= 每孔加入的慢病毒颗粒的总ml

嘌呤霉素滴定（使用筛选方法时）

使用新细胞类型时，应进行嘌呤霉素滴定（杀灭曲线）。

1. 将1.6 x10⁴个细胞加入装有120 µL新鲜培养基的96孔板的孔中。
2. 第二天在选定的孔中加入500–10,000 ng/mL嘌呤霉素。
3. 每2天检查一次活性。
4. 培养10-14天。每3天更换一次含嘌呤霉素的培养基。
5. 该细胞类型应使用3-5天后导致完全细胞死亡的嘌呤霉素的最低浓度。

在我们的实验方案网站页面，提供了一系列全网公开的实用 shRNA 实验方案。

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MISSION^® TRC shRNA文库可在线订购。您必须首先创建在线个人资料并勾选表中的“request web ordering access”（请求网络订购权限）框。创建个人资料并通过审核后，即可将克隆加入您的购物车。

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如需更多帮助，请发送电子邮件至missionrnai@milliporesigma.com。

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