主页基因表达和基因沉默载体图谱

载体图谱

MISSION 研发团队与RNAi 联盟 (TRC)科学家合作，创造了一系列有助于成功开展RNAi实验的载体。基础载体 pLKO.1-puro 由 Broad Institute（TRC一员）开发。我们对 TRC 的贡献是多种用于关键对照实验的载体，以及用于定制 shRNA 生产的载体。本页面包含这类载体相关的信息。

pLKO.1-puro 序列（无 shRNA 插入）

TTRC1.5 载体：pLKO.1-puro
TRC1.5 对照载体
 TRC1.5 备用载体骨架
 TRC2 载体：TRC2-pLKO-puro
诱导型 shRNA 载体
 慢病毒包膜载体
 参考文献

TRC1.5载体：pLKO.1-puro载体和应用

TRC1.5 克隆与 TRC1 克隆具有完全相同的载体骨架

pLKO.1-puro 载体的特征支持瞬时或稳定转染 shRNA 以及产生慢病毒颗粒。¹使用嘌呤霉素筛选标记筛选稳定的基因沉默，同时通过与兼容的包膜质粒共转染，可在包膜细胞(HEK293T)中生成自失活的不可复制病毒颗粒。^2,3作为我们产品组合独有的产品，TRC1.5 包含近 200,000 个克隆——包括逾49,000 个经过验证的克隆。它包含 TRC1 的所有内容，以及针对 2,661 个新人类基因和 2,395 个小鼠基因的另外 39,212 个克隆。与腺病毒或鼠类 MMLV 或 MSCV 逆转录病毒系统不同，慢病毒颗粒可有效感染特定 shRNA 构建体并掺入分化和非分裂细胞（例如神经元和树突细胞）中，克服了使用这些细胞系时的低转染和掺入困难问题。相对于siRNA和其他基于载体的系统，pLKO.1-puro为长期敲低和表型观测、复杂或敏感细胞系（非分裂细胞或原代细胞）转导提供了解决方案，且是一种经济的可再生资源。

pLKO.1-puro 质粒插入 shRNA 后，长度为 7,086 bp，如下方载体图谱所示。无 shRNA 插入片段时，pLKO.1-puro 载体长度为 7,052 bp。此处提供的序列档案是无插入片段的 pLKO.1-puro 载体（7,052 bp）。

TRC1.5载体图谱 (pLKO.1-puro)

TRC1.5 载体描述及特征

TRC1.5对照载体

我们提供各种对照，助您开展最严格、详实的 shRNA 实验。请访问 shRNA 对照页面了解更多信息

TRC1.5 备用载体骨架

作为我们标准 shRNA 产品线的一部分，我们提供各种备用载体骨架。通过我们的自定义 MISSION shRNA 订购界面，可直接在质粒 DNA 或慢病毒转导颗粒克隆详情页面在线订购这类载体骨架的 TRC shRNA。如需定制发夹结构，请访问我们的定制克隆页面了解订购详情。

我们还提供多种含荧光蛋白或 UbC 启动子的备用载体骨架。这类构建体仅作为定制选项提供。请访问我们的自定义克隆页面，了解订购详情。

TRC2载体：TRC2-pLKO-puro载体和应用

TRC2-pLKO-puro 载体还可用于瞬时或稳定转染 shRNA 以及慢病毒颗粒生产。TRC1.5 载体和 TRC2 载体之间的唯一区别是添加了 WPRE（土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件）。⁴此元件可增强慢病毒递送的转基因表达。⁵与 TRC1.5 一样，TRC2 通过嘌呤霉素筛选标记实现稳定的基因沉默。利用表达载体与相容包装质粒共转染包装细胞(HEK293T)，可生产自灭活复制缺陷病毒颗粒。pLKO.1-puro为长期敲低和表型观测、复杂或敏感细胞系（非分裂细胞或原代细胞）转导以及增强转基因表达提供了解决方案。

插入 shRNA 后，TRC2-pLKO-puro 质粒长度为 7,518 bp，如下方载体图谱所示。无 shRNA 插入片段时，TRC2-pLKO-puro 载体长度为 7,484 bp。此处提供的序列档案是无插入片段的 TRC2-pLKO-puro 载体（7,484 bp）。

TRC2-pLKO-puro 序列（无 shRNA 插入）

TRC2 载体图谱 (TRC2-pLKO-puro)

请注意：目前，TRC2 暂无备用载体骨架。

诱导型 shRNA 载体

pLKO 载体经过重新设计，包含 LacI（阻遏蛋白）以及带有 LacO（操纵基因）序列的修饰人 U6 shRNA 启动子。无 IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，一种乳糖类似物）的情况下，LacI 可与 LacO 结合，阻止 shRNA 表达。存在 IPTG 时，变构 LacI 阻遏蛋白会改变构象，从 lacO 修饰的人 U6 启动子中释放，从而允许 shRNA 表达。

我们非常自豪可针对实际研究同时提供两种不同的 IPTG 诱导型载体。首选诱导型载体pLKO-puro-IPTG-3xLacO包含三个 lac 操纵子序列（两个位于 U6 启动子中，一个位于启动子 3' 端），可提供严格的调控和良好的基因沉默效果。而 pLKO-puro-IPTG-1xLacO 载体的 U6 启动子包含单个 lac 操纵子序列，有利于 shRNA 表达，但在未诱导时对启动子可控性较差。

慢病毒包膜载体

最后，如客户希望自行包膜慢病毒，我们还可提供优化的包膜混合物。请访问包膜混合物页面了解更多详情。

参考文献

Stewart, S. A. et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA 2003, 9, 493–501.. https://doi.org/10.1261/rna.2192803

Zufferey, R. et al. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nat. Biotechnol 1997, 15, 871–85.. https://doi.org/10.1038/nbt0997-871

Zufferey, R. et al. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J. Virol. 1998, 72, 9873–80.. https://doi.org/10.1128/JVI.72.12.9873-9880.1998

Donello J. E. et al. Woodchuck hepatitis virus contains a tripartite posttranscriptional regulatory element. J. Virol. 1998, 72, 5085-92.. https://doi.org/10.1128/JVI.72.6.5085-5092.1998

Zufferey, R. et al. Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances expression of transgenes delivered by retroviral vectors. J. Virol. 1999, 73, 2886-92.. https://doi.org/10.1128/JVI.73.4.2886-2892.1999

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