细菌转化实验方案

标准转化实验方案

1. 将所需数量的试管从-70°C冰箱转移到湿冰中。如果需要，额外取用一个试管用于对照DNA。
2. 让细胞解冻5分钟。轻弹培养管多次以获得均匀的悬浮液。
   1. 对于对照：将1 μL（10 ng）pUC19对照DNA加入一个试管中。轻弹试管以便混合，并置于冰上。
   2. 将1 ng至50 ng纯化的质粒DNA直接加入其余试管的细胞中。轻弹试管以便混合，并置于冰上。
3. 将细胞在冰上孵育30分钟。
4. 将细胞转移到37°C水浴中静置刚好45秒。
5. 将细胞转移至冰上静置2分钟。
6. 将SOC培养基添加到每个试管中。将细胞转移到无菌聚丙烯试管中，并松开盖子以便培养物通气。
7. 将细胞在摇床培养箱（225-250 rpm）上于37℃孵育1小时。
8. 移取10-100 μL每种转化的细胞悬浮液到含有选择抗生素的LB琼脂板上，并用无菌涂布器涂抹。
9. 将板在37℃孵育过夜。
10. 根据需要选择一个（多个）菌落和培养物。
11. 从每种培养物中分离质粒DNA。
12. 培养优选的克隆。
13. 使用限制酶消化质粒DNA，用凝胶电泳分离。

使用电转感受态细胞转化的实验方案

所需材料（未提供）：

标准转化实验方案

1. 将所需数量的试管从-70°C冰箱转移到湿冰中。如果需要，额外取用一个试管用于对照DNA。
2. 让细胞解冻5分钟。轻弹培养管多次以获得均匀的悬浮液。
3. 将SOC培养基转移至培养管中，每个转化反应一个管，并置于室温下。
   
   （SOC培养基的体积取决于下一步中将要添加的细胞体积。感受态细胞和SOC培养基的最终体积应为1000μL。）
4. 将1 mm标准比色皿和无菌微量离心管置于冰上，每个转化反应配一套。
5. 将感受态细胞转移到冷冻的微量离心管中。使用来自80 μL包装的40 μL细胞以及来自100 μL包装的50 μL细胞。
   1. 对于对照：将1 μL的1至5倍稀释的pUC19对照DNA添加至一个试管中。
   2. 在TE缓冲液中制备DNA或Ligation Mix的1至5倍的稀释液。添加至微量离心管中。
6. 将DNA和细胞混合物移液到冷冻的1 mm比色皿中。
7. 将电穿孔仪设置为25 kV/cm的场强6ms，并处理细胞。
8. 从比色皿中取出细胞，添加至含有SOC培养基的试管中。
9. 将细胞在摇床培养箱（225-250 rpm）上于37℃孵育1小时。
10. 移取10-100 μL每种转化的细胞悬浮液到含有选择抗生素的LB琼脂板上，并用无菌涂布器涂抹。
11. 将板在37 ℃孵育过夜。
12. 根据需要选择一个菌落和培养物。
13. 从每种培养物中分离质粒DNA。
14. 使用限制酶消化质粒DNA，用凝胶电泳分离。
15. 培养优选的克隆。

优化转化过程的重要提示：

• 确认收到时细胞仍处于冷冻状态，且仍然有干冰。
• 为了获得最大的转化效率，请使用不含苯酚、乙醇、蛋白质、盐或去垢剂的优质DNA样品。使用电转感受态细胞时，DNA中的高盐含量会导致高压电弧，这可能会损坏样品和设备。
• 含有优质试剂的连接反应中的DNA可用于转化。DNA连接酶不需要灭活。
• 始终将感受态细胞保持在冰上，防止细胞意外升温。
• 轻弹培养管以获得均匀的细胞悬浮液。请勿使用涡旋或移液器混合。
• 将LB琼脂板温热至37 °C，以获得最佳的菌落生长。
• 使用电转感受态细胞进行转化的电穿孔仪设置：
  • BTX Model ECM 630：HV模式，2.5 kV，25 μF，100 Ω，1 mm比色皿
  • BioRad基因脉冲发生器：2.5 kV，25 μF，100 Ω，1 mm比色皿