5'-核苷酸酶的酶促检测

1.目标

建立5'-核苷酸酶酶促测定的标准化操作流程。

2.适用范围

本操作流程适用于所有测定5'-核苷酸酶活性参数的产品。本操作流程不可用于测定来自牛肝的5^’-核苷酸酶（N2779），或来自东部菱背响尾蛇不溶性的5^’-核苷酸酶（N3264）或5’-核苷酸酶作为杂质的样品。

3.定义

3.1 纯水 - 来自去离子系统的水，电阻率>或=18MΩ•cm @25 ºC

3.2 单位定义=在pH 9.0、37 ℃条件下，一单位每分钟可从腺苷5'-一磷酸中水解出1.0微摩尔的无机磷。

3.3 STD =磷标准品

3.4 5’-AMP = 腺苷5'-单磷酸。

3.5 P_i =无机磷酸盐

3.6 TSCR = Taussky-Shorr显色剂

4.讨论

5^’-AMP + H₂O ^{5'-核苷酸酶} >腺苷+ P_i

5.责任

分析服务实验室人员应遵循本书面操作流程。

6.安全

有关危险和适当的操作注意事项，请参阅安全数据说明书(SDS)。

7.操作流程

7.1 条件：
T = 37°C，pH = 9，A_660nm，光程= 1cm

7.2 方法：
光谱法终止反应

7.3 试剂：

7.3.1 200mM甘氨酸缓冲液，pH 9.0，37 ℃（缓冲液） 利用纯水和甘氨酸（G7126）配制15 mg/mL的溶液。在37 ℃条件下，用1 M NaOH调节至pH 9.0。

7.3.2 66 mM腺苷5'-单磷酸盐溶液(5'-AMP)

7.3.2.1 利用纯水和酵母5'-一磷酸腺苷钠盐（A1752）配制22.9 mg/mL的溶液。

7.3.2.2 通过高压液相色谱测定水百分比、钠百分比和纯度百分比，以校正腺苷5'-单磷酸盐浓度。

7.3.3 200 mM硫酸镁溶液(MgSO₄) 利用纯水和硫酸镁七水合物（M1880）配制49.3 mg/mL的溶液。

7.3.4 磷标准品(STD) 使用磷标准品溶液，0.645 μ moles/ mL（P3869）。

7.3.5 10 N硫酸溶液(H₂SO₄)利用低温纯水和硫酸（95-98％，A.C.S.试剂（258105）。

7.3.6 10%(w/v) 钼酸铵溶液[(NH₄)₆MO₇O₂₄]

7.3.6.1 利用试剂7.3.5(H₂SO₄)和钼酸铵四水合物（A7302）配制100 mg/mL的溶液。这一过程可能需要超过8小时的搅拌才能溶解。

7.3.6.2 如果没有Sigma-Aldrich货号A7302产品，可换用钼酸铵四水合物（M0878）。

7.3.6.3 10%(w/v) 钼酸铵溶液在室温、黑暗条件下可稳定6个月。

7.3.7 Taussky-Shorr显色剂 (TSCR)

7.3.7.1 将10ml试剂7.3.6[(NH₄)₆MO₇O₂₄]加入70mL纯水中制备100mL溶液。

7.3.7.2    随后加入5 g的七水硫酸亚铁（F7002）。

7.3.7.3 混合至溶解，用纯水稀释至终体积100 mL。

7.3.8 5’-核苷酸酶溶液（酶）

7.3.8.1 临使用前，利用低温纯水配制约100单位/mL的溶液，涡旋至溶解。

7.3.8.2 立即利用低温纯水将试剂7.3.8.1稀释至40-60单位/mL。每次进行检测都需要进行新鲜稀释。

7.4 操作流程

7.4.1 检测方案-1

7.4.1.1 将下列试剂加入(mL)适宜的容器中：

7.4.1.2 旋转混匀并平衡至37 ℃。然后添加：

7.4.1.3 旋转混匀，在37 ℃下将试样-1孵育1.0分钟整，将试样-2孵育2.0分钟整。然后添加：

7.4.1.4 倒置混匀并在室温下孵育5分钟。转移到适宜的比色皿中，使用合适的分光光度计测量试样-1、试样-2和空白样-1与纯水在A660nm处的吸光度。

7.4.1.5 如果结果不一致，则重复步骤7.4.1.1至7.4.1.4。

7.4.2 检测方案-2

7.4.2.1 将下列试剂加入(mL)适宜的容器中：

7.4.2.2 旋转混匀并平衡至37 ℃。然后添加：

7.4.2.3 旋转混匀，在37 ℃下将试样-1孵育1.0分钟整，将试样-2孵育2.0分钟整。然后添加：

7.4.2.4 倒置混匀并在室温下孵育5分钟。转移到合适的比色皿中，使用合适的分光光度计测量试样-3、试样-4和空白样-2与纯水的在660 nm处的吸光度差异。

7.4.2.5 如果结果不一致，则重复步骤7.4.2.1至7.4.2.4。

7.5 标准曲线

7.5.1 将下列试剂加入（mL）至带有通气盖的适宜容器中，绘制标准曲线：

7.5.2 颠倒混匀并在室温下孵育5分钟。转移至适宜的比色皿中，使用合适的分光光度计测量标准品和标准空白样与纯水在A660nm处的吸光度差异。

7.6 计算

7.6.1    标准曲线

    ΔA_660nm 标准品 = A_660nm Std - A_660nm 标准空白样

    绘制标准品-磷的ΔA_660nm相对关系图。计算并记录斜率、y轴截距和线性回归(r2).

7.6.2 样品测定

    ΔA_660nm 样品 = A_660nm试样-1或试样-2 - A_660nm测试空白样-1

    Δ_A660nm 样品 = A_660nm 试样-3或试样-4 - A_660nm测试空白样-2

    使用标准曲线确定释放的磷的微摩尔量。

df =稀释系数
0.005= 所用的酶体积(ml)或
0.010= 所用的酶体积(ml)
T= 每单位反应体系的反应时间(min)

7.7 最终检测浓度：
在2 mL反应混合物中，终浓度为150mM甘氨酸、10mM硫酸镁、5.0mM腺苷5.0'-单磷酸和0.2-0.6单位的5'-核苷酸酶。