改良Boehenger法酶促检测α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)

文档记录

参见QUMAS 变更申请号SOP-DEK-ENZ53。

1.目标

在Sigma-Aldrich（圣路易斯州）建立改良Boehenger法酶促检测α-葡萄糖苷酶的标准流程。

2.适用范围

该流程适用于可检测α-葡萄糖苷酶活性的所有产品。

3.定义

3.1纯水 – 来自去离子系统的水，电阻率>或= 18MΩ•cm @ 25 ºC

3.2.单位定义 – 在pH 6.0、温度25°C条件下，一个单位每分钟可将1.0微摩麦芽糖转化为2 mole D-葡萄糖。

3.3.ATP –腺苷-5'-三磷酸

3.4.ATP –腺苷-5'-二磷酸

3.5.G-6-P –萄糖-6-磷酸

3.6.NADP⁺ – β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（氧化形式）

3.7.NADP+ –β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（还原形式）

3.8.G-6-PDH –葡萄糖-6-磷酸脱氢酶

4.讨论

麦芽糖 + H₂O ^{α – 葡萄糖苷酶}> 2(α - D – 葡萄糖)

2(α - D – 葡萄糖) + 2(ATP)^己糖激酶> 2(G - 6 - P) + 2(ADP)

2(G - 6 - P) + 2NADP^+ G-6-PDH> 2(6 -磷酸葡萄糖酸) + 2(NADPH) + 2H⁺

5.责任

任何分析服务实验室人员有责任遵守本文所述流程。

6.安全

有关危险因素及合适的操作注意事项，参阅安全数据说明书（SDS）。

7.操作流程

7.1 条件：
温度= 25°C，pH = 6.0，A_340nm，光程= 1 cm

7.2 方法：
光谱法终止/终点测定

7.3 试剂：

7.3.1     7.3.1.100 mM醋酸钠，0.05% (w/v)四水合物无水乙二胺四乙酸四钠，pH 6.0， 25 °C（缓冲液）
采用纯水，制备13.61 mg/ml三水合物醋酸钠（Sigma-Aldrich货号S8625）溶液和0.55 mg/ml四水合物无水乙二胺四乙酸四钠（Sigma-Aldrich货号ED4SS）溶液。将pH在25 °C下调至6.0。

7.3.2     20% (w/v)麦芽糖
采用纯水和I级一水麦芽糖（Sigma-Aldrich货号 M5885）制备200 mg/ml的溶液。

7.3.3     葡萄糖HK检测试剂(HK)
使用前，按照标签上标示的体积，现场溶解一瓶葡萄糖(HK)检测试剂（Sigma-Aldrich货号G3293）。

7.3.4    α-葡萄糖苷酶（酶）
临加入反应混合物之前，采用低温纯水现配含3-5 units/ml的溶液。

7.4 步骤 1 – 酶终止反应

7.4.1 启动沸水浴，加热至沸腾。.

7.4.2 将下列试剂(ml)加入适宜的容器中：

7.4.3.    倒置混匀，等待温度调至25 °C，然后加入：

7.4.4.    涡旋混匀，在25 °C水浴中孵育整整5分钟。涡旋混匀，在25 °C水浴中孵育整整5分钟。5分钟沸水浴后，加入：

7.4.5.    再沸水浴5分钟，然后离心5分钟。倒入第7.5步（步骤2）所用的上清液。

7.5.7.4 步骤 2 – 酶活性测定

7.5.1.    将下列试剂(mL)加入适宜的培养皿中：

7.5.2.    使用适宜的恒温光谱分析仪调整至25 °C，记录所有试样和空白样反应混合物的初始A_{340 nm} (AI)。然后添加：

7.5.3.    倒置混匀，监测A_{340 nm}增量，直至Δ A_{340 nm}/min≤0.0020，此速率须至少维持5分钟。记录最终的A_{340 nm} (A_F)。校正后的A_340nm应处于0.20至0.55范围内。

7.6 计算

7.6.1    ΔA = A_F - A_I

7.6.3.    3.00 = 第7.5步（步骤1）中的反应混合物体积(ml)
    2.00 = 第7.4步（步骤2）
中的反应混合物体积(ml)    df = 酶稀释系数
    6.22 = NADPH
的毫摩消光系数    2 = 每µmole麦芽糖的NADPHµmole数
    0.10 = 第7.4步（步骤1）
反应混合物中所用的酶体积    0.10 = 第7.5步（步骤2）
反应混合物中所用的酶体积    5 = 孵育时间(min)

7.7最终检测体系浓度：
NA

8.参考文献和附件

NA

9审批

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