DNA损伤和修复

DNA的损伤与修复机制

突变的形成和癌症的发展均涉及细胞DNA的损伤。人体细胞中的DNA每天都会遭受数千次到百万次由外部（外源）和内部代谢（内源）带来的破坏。在DNA的转录和随后转译成信号传导和细胞功能必需的蛋白质的过程中，细胞基因组的改变可能会导致错误的产生。如果基因组突变未能在有丝分裂前得到修复，则该突变也可能会携带到子细胞中。一旦细胞无法有效修复受损的DNA，将会产生三种可能的应答（见图1）。

1. 细胞可能会衰老，即进入不可逆的休眠状态。2005年，多个实验室研究发现，在体内和体外实验中，癌细胞均可发生衰老现象，停止有丝分裂并阻止细胞的进一步进化。^1-4
2. 细胞可能会凋亡。足量的DNA损伤会启动一个凋亡信号级联反应，强迫细胞进入细胞死亡程序。
3. 细胞会恶变，即具有永生特性并开始不受控制的分裂。

为了弥补已发生的不同程度不同类型的DNA损伤，细胞会进行多种不同修复程序，包括错配、碱基切除和核苷酸切除修复机制，各机制之间基本不会出现冗余处理。如果发生了过度损伤，无法通过消耗能量来有效修复的话，细胞会进入到衰老或凋亡过程。细胞能有效修复损伤的几率取决于细胞的种类和年龄。

DNA损伤的来源

多年来，外源损伤一直被认为是引起致癌DNA突变的主要因素。但是，Jackson和Loeb认为，内源导致的DNA损伤也极大有助于引起致癌突变。⁵来自环境和细胞的诱因可以造成相似的DNA损伤。

DNA可以被物理的和化学的诱变剂攻击。物理诱变剂主要是各种辐射源，包括来自太阳的UV（200-300 nm波长）辐射。UV辐射可以在DNA链的相邻嘧啶（胞嘧啶和胸腺嘧啶）的碱基之间形成共价键从而产生交联。电离辐射（X光）在细胞内生成自由基，从而产生活性氧（ROX），造成双螺旋结构中单链和双链断裂，引发DNA突变。化学诱变剂可以将烷基共价连接到DNA碱基上；氮芥化合物可以甲基化或乙基化DNA碱基，是一种DNA烷化剂。前致癌物是化学惰性的前体物质，可以通过代谢转化为高活性的致癌物质。这些致癌物质可以与DNA反应，形成DNA加合物，即一种连接到DNA上的化学实体。苯并[a]芘是一种多环芳烃，本身并不致癌， 在细胞色素P450酶作用下，经过两个连续的氧化反应，生成环氧苯并[a]芘（BPDE），后者是一种致癌代谢物，可以形成共价DNA加合物（见图2）。

DNA 损伤也可能是由内源代谢或生化反应导致，其中一些过程还未被充分了解。⁶水解反应可以将核苷酸碱基从DNA链上部分或全部切割下来。连接嘌呤碱基（腺嘌呤或鸟嘌呤）和脱氧核糖磷酸链的化学键在被称为脱嘌呤的过程会自发断裂。在哺乳动物细胞中，每天估计会发生10,000次脱嘌呤事件。⁷而脱嘧啶（从胸腺嘧啶或胞嘧啶中失去嘧啶碱基）的发生概率会比脱嘌呤低20-100倍。

脱氨基作用是指在细胞内，腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶环失去氨基，分别变成次黄嘌呤、黄嘌呤和尿嘧啶。DNA修复酶能够识别并修正这些异常碱基。但是，未被修正的尿嘧啶在之后的DNA复制过程中可能会被误读为胸腺嘧啶从而产生C→T点突变。

DNA甲基化是由细胞内的S-腺苷甲硫氨酸（SAM）反应引起的一种特殊形式的烷基化。SAM是一种细胞内代谢中间体，含有高活性的甲基基团。在哺乳动物的细胞中，甲基化发生在胞苷碱基（C）的胞嘧啶环的5号位置上，对应鸟嘌呤碱基（G）的5’，即序列CpG。甲基化产物5-甲基胞嘧啶的自发的脱氨基作用是突变错误的一个主要来源。氨基的丢失会产生一个胸腺嘧啶碱基，后者不会被DNA修复酶认定为异常碱基， 从而使得这一置换在DNA复制中被保留，形成C→T点突变（见图3）。

正常的代谢过程会产生活性氧（ROS），后者会通过氧化反应修饰碱基。嘌呤和嘧啶类碱基均会被氧化。最常见的突变是鸟嘌呤被氧化成8-氧代-7,8-二氢鸟嘌呤，从而形成核苷酸8-氧代-脱氧鸟苷（8-oxo-dG）。8-oxo-dG可以与脱氧腺苷碱基配对，而不是预期的脱氧胞苷。如果这一错误未被错配修复酶发现并修正，则之后复制的DNA将会包含C→A点突变。ROS也可能会引起DNA脱嘌呤、脱嘧啶以及单链或双链的断裂。

在细胞周期的S期进行的DNA复制可能会引入其他类型的基因突变。复制DNA模板的聚合酶有很小的但不可忽视的错误率，对比模板DNA，会将错误的核苷酸按Watson-Crick配对原则整合进合成链中。发生化学改变的核苷酸前体也可能被聚合酶整合进合成的DNA中，取代正常的碱基。此外，在复制含有大量的重复氨基酸或者重复序列（微卫星区域）的DNA片段时，聚合酶容易发生“打滑”现象。当模板DNA链和复制的DNA链滑脱正确的排列时，链的滑动会导致出现这一酶学上的“打滑”现象。后果是聚合酶无法正确插入模板DNA指定数量的核苷酸，导致子链核苷酸过多或过少。

DNA的单链和双链可能会发生断裂。单链的断裂可能是由于DNA脱氧核糖磷酸链上的脱氧核糖部分的损伤引起的。在AP-核酸内切酶1去除脱氧核糖磷酸基团后进行的碱基切除修复路径的中间步骤也可能发生断裂。⁸当单链断裂发生时，核苷酸碱基和脱氧核糖骨架都会从DNA结构上丢失。双链断裂最常发生在细胞传代的S期中，此时DNA解开螺旋以作为复制模板，从而更容易断裂。

DNA修复机制

细胞可以进化到凋亡或衰老状态，这可以看成是细胞最终的手段。对于不同的DNA损伤，细胞会进化出特定的方法修复损伤或清除损伤化合物。

O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（MGMT；DNA烷基转移酶）从DNA结构的鸟嘌呤碱基上切除甲基和乙基加合物。这一反应并不是催化（酶促）反应，而是化学计量（化学）反应，每去除一个加合物，就消耗一个分子的MGMT。经过改造的MGMT过表达的细胞对于癌症的耐受性更强，这可能是因为它们可以抵消更多的烷基损伤。Niture等人最近的一项研究表明，使用半胱氨酸/谷胱甘肽加强的药物和天然抗氧化剂，可以提高MGMT的表达。⁹

具有校正活性的DNA聚合酶，例如聚合酶-δ，主要参与复制错配的修复。当错配被检出时，这些聚合酶会停止DNA复制过程，退回去消除子链DNA上的核苷酸，直至错配核苷酸被消除，然后再重新开始正向的复制过程。研究数据显示，相对于野生型或单拷贝突变的小鼠来说，在Pold1基因双拷贝过程中均发生点突变的小鼠表现出DNA聚合酶-δ校正活性的损失，并且上皮性肿瘤的发病率明显上升。¹⁰

被称为错配切除修复（MMR）酶的一组蛋白质可以修正复制过程中DNA聚合酶的校正活性未检出的错误。MMR酶可以切除子链DNA上的错误核苷酸，并以母链DNA作为正确的模板，通过W-C配对修复链。¹¹这一点对于微卫星区域复制中产生的错误尤其重要，因为DNA聚合酶的校对活性无法检测出这些错误。在有限程度内，MMR酶可以修正由DNA氧化或烷化导致的多种碱基配对异常。这些突变包括含有O6-甲基鸟嘌呤和8-氧鸟嘌呤的修饰碱基对、致癌物质和顺铂加合物。^12,13人类错配切除修复基因MSH2和MLH1的突变与遗传性非息肉性结直肠癌（HNPCC）综合症有关。¹⁴

碱基切除修复和核苷酸切除修复

碱基切除修复（BER）过程包含多种酶来对单一受损的核苷酸碱基进行切除和替换。BER酶主要修复由内源氧化作用和水解作用导致的碱基修饰。DNA糖基化酶切割核苷酸碱基和核糖间的化学键，得到完整的DNA核糖磷酸链，但是会产生无嘌呤或无嘧啶（AP）的位点。8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶（Ogg1）可以除去7,8-二氢-8-氧鸟嘌呤（8-oxoG），后者是一种由活性氧引起的碱基突变。人OGG1基因的多态性与多种癌症如肺癌和前列腺癌的风险相关。尿嘧啶DNA糖基化酶是另一种BER酶，可以切除胞嘧啶脱氨基产生的尿嘧啶，从而防止随后的C→T点突变。¹⁵N-甲基嘌呤DNA糖基化酶（MPG）可以去除大量被修饰的嘌呤碱基。¹⁶

由BER酶反应产生的以及由脱嘧啶和脱嘌呤作用产生的DNA中的AP位点，可以被AP-核酸内切酶1（APE1）修复。APE1可以切割AP位点磷酸二酯链的5’位置， 使得DNA链产生3’-羟基基团和5’-碱基脱氧核糖磷酸基团。DNA聚合酶β（Polβ）基于相应的W-C配对插入正确的核苷酸，并通过相关的AP裂解酶活性去除脱氧核糖磷酸基团。X射线修复交叉互补组1（XRCC1）的存在对于DNA连接酶III（LIG3）形成异二聚体是必须的。XRCC1充当支架蛋白，为Polβ提供一个非活性结合位点，并将Polβ和LIG3酶一同带至修复位点。¹⁷聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP-1）与XRCC1和Polβ相互作用，是BER途径的必要组成部分。^18,19修复的最后一步是由LIG3完成的，它将用来替代核苷酸的脱氧核糖与脱氧核糖磷酸骨架连接起来。这一修复途径被称作“短补丁BER”。²⁰

另一条被称作“长补丁BER”的修复路径可以置换最小长度为2个核苷酸的核苷酸链。据报道，该途径可以修复10到12个核苷酸长度的核苷酸链。^21,22长补丁BER需要增殖细胞核抗原（PCNA）作为重建酶的支架蛋白。²³其他的DNA聚合酶，可能为Polδ和Polε，²⁴用于生成寡核苷酸瓣状侧翼。已有的核苷酸序列被瓣状核酸内切酶-1（FEN1）去除， 随后寡核苷酸通过DNA连接酶 1（LIG1）连接至DNA上，填补缺口并完成修复。¹⁷ 有关短补丁BER和长补丁BER途径选择的机制仍然在研究中（见图4）。²⁵

尽管BER可以通过长补丁途径置换多个核苷酸，但短补丁和长补丁BER都是由单个核苷酸的损伤引起的，从而将对DNA双螺旋结构的影响降至最低。核苷酸切除修复（NER）可以修复产生了DNA结构扭曲的核苷酸链（含至少2个碱基）的损伤。除了修复由较大的DNA加合物和UV射线的外源因素造成的连续性损伤外，NER还可以修复单链断裂。²⁶该途径还可以用于修复氧化应激造成的损伤。²⁷在哺乳动物细胞中，有超过20种蛋白质参与了NER途径，包括XPA、XPC-hHR23B、复制蛋白A（RPA）、转录因子TFIIH、XPB和XPD DNA解旋酶、ERCC1-XPF和XPG、Polδ、Polε、PCNA和复制因子C。²⁸切除修复交叉互补（ERCC1）基因的过度表达与非小细胞的肺癌细胞的顺铂耐受性有关，²⁹并可以增强DNA修复能力。³⁰全基因组NER（GGR）可以修复整个基因组内的损伤，而被称作转录偶联修复（TCR）的特殊的NER途径可以在活性RNA聚合酶转录过程中修复基因。³¹

双链断裂修复

DNA的双链断裂可以导致基因序列的丢失和重排。这些断裂可以通过非同源末端连接（NHEJ）或者同源重组（HR）来修复，也被称作重组修复或模板辅助修复。

当细胞处于S/G2阶段后期且模板近期被复制时，HR途径被激活。这一机制需要一个通过着丝粒与DNA受损区域连接的相同或近乎相同的序列作为修复模板。通过该机制修复的双链断裂通常是因为复制机试图跨过单链的断裂位置或未修复的损伤进行合成，导致了复制叉结构的崩溃而引起的。

在细胞循环的其他节点，当姐妹染色体不能作为HR模板时，会启动非同源末端连接（NHEJ）途径。当断裂发生时，细胞不会复制包含断裂部位的DNA区域，因此与HR途径不同，没有相应的模板链可用。在NHEJ途径中，Ku异二聚体蛋白位于断裂的DNA链的两端，在没有模板可用的情况下进行修复，因此在该过程中可能会丢失序列信息。有多种酶参与了重连过程，包括DNA连接酶IV，XRCC4和DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK）。^32,33NHEJ具有内在的致突变性，因为它依赖于两条需要连接的DNA片段的单链尾端的机会配对，称为微同源性（见图5）。在高级真核细胞中，DNA-PK对NHEJ修复是必需的，无论是主要机制还是替代性的备用机制（D-NHEJ）。³⁴

未来的应用

虽然DNA损伤是癌细胞发展和进化的关键因素，连续性的损伤仍然被用作癌症临床治疗的一部分，用于迫使恶性细胞进入凋亡或衰老状态。很多化学治疗药物是有效的，例如博来霉素、丝裂霉素和顺铂，因为它们会对复制速率比周围组织快的癌细胞造成进一步的DNA损伤。细胞DNA修复机制是一把双刃剑，一方面它可以减少致癌突变，从而保证基因组的完整性，但是另一方面，在恶性细胞中，同样的机制又会使得细胞免于更多的DNA损伤并持续不可控增长。为了阻断癌细胞内的这一存活机制，临床试验中现在开始使用特定DNA修复酶（包括MGMT、PARP和DNA-PK）的抑制剂。^35-38