ELISA 操作步骤

• 间接ELISA
  
• 捕获ELISA

间接ELISA

试剂和设备

1. 磷酸盐缓冲盐（PBS）片剂：10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4，150mM NaCl（货号P4417)和0.1％叠氮化钠（货号S2002)。
2. 碳酸盐-碳酸氢盐缓冲胶囊，pH9.6（货号C3041)。
3. 洗涤液（PBS-T）：10mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，150mM NaCl，0.05％Tween 20（货号P3563)
4. 单克隆一抗。
5. 对照抗体：物种和同种型匹配的非特异性免疫球蛋白（例如作为小鼠单克隆一抗对照的小鼠骨髓瘤蛋白）
6. 碱性磷酸酶标记的二抗或过氧化物酶标记的二抗
7. 碱性磷酸酶标记的二抗（例如SIGMAFAST™ pNPP片剂，货号 N1891) 的底物，或者过氧化物酶标记的二抗（诸如SIGMAFAST™ OPD片剂，货号P9187）的底物。
8. 碱性磷酸酶终止试剂：3 M NaOH（可选）或过氧化物酶终止试剂：3M HCl或3 M H₂SO₄（可选）
9. 微量滴定板
10. 配备有405nm或450/492nm滤光片（分别用于pNPP或OPD）的酶标仪。
    

操作流程

• 抗原包被
  
• 一抗反应
  
• 二抗结合
  
• 底物制备
  
• 显色

抗原包被

1. 采用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液或PBS中制备适当浓度的抗原溶液。
2. 微量滴定板的每个孔中加入0.2ml上述溶液。
3. 37°C孵育30分钟，或4°C孵育过夜（需完全覆盖）。
4. 去除包被液，用PBS-T洗涤三次。
   
   注意：如果发生非特异性结合的问题，可能需要额外的封闭步骤（5％BSA-PBS，30分钟）。 欲了解更多信息，请参阅：Vogt, R.F., et al., J. Immunol. Meth., 101, 43 (1987).

一抗反应

1. 用PBS-T稀释单克隆一抗。最佳浓度应使用滴定法来确定。
2. 每孔加入0.2ml稀释的单克隆抗体。阴性对照应该是在PBS-T中稀释的物种和同种型匹配的非特异性免疫球蛋白。
3. 室温孵育2小时。
4. 洗涤步骤同抗原包被的步骤4。

二抗结合

1. 用PBS-T稀释酶结合的二抗。每孔加入0.2ml该溶液。最佳浓度应使用滴定法来确定。
2. 室温孵育2小时。
3. 洗涤步骤同抗原包被的步骤4。

底物制备

1. 在使用之前，最后一次孵育期间，准备酶底物或将预制底物液置于室温。

显色

1. 每孔加入0.2ml新鲜制备的底物。
2. 30分钟后，阳性孔中应显色（pNPP或OPD分别为黄色或橙色）。
3. 可以直接在酶标仪（405nm或450nm，分别用于pNPP或OPD）中读取吸光度，或者可以用合适的终止试剂（每孔50μl）停止反应，以后读取吸光度（405nm 或492nm，分别用于pNPP或OPD）。

捕获ELISA

捕获ELISA（也称为“三明治”ELISA）是一种灵敏的方法，可用来定量许多皮克到微克级别的物质（如激素，细胞信号化学物质，传染病抗原和细胞因子）。几个原因使得需要这种类型的ELISA而不是直接或间接ELISA：待分析的物质可能太稀而不能与聚苯乙烯微量滴定板结合（如细胞培养上清中的蛋白质），或与塑料结合不佳（如小的有机分子），可能混合了太多的其他物质以至于不能很好的与平板结合。描述及利用捕获ELISA的两个Sigma试剂盒是TNF-α试剂盒和小鼠分型试剂试剂盒（货号ISO2）。

试剂和设备

1. 磷酸盐缓冲盐（PBS）：10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4,150mM NaCl片剂（货号P4417）和0.1％叠氮化钠（货号S2002）
2. 碳酸盐-碳酸氢盐缓冲胶囊，pH9.6（货号C3041）
3. 洗涤液（PBS-T）：10mM磷酸盐缓冲液pH7.4,150mM NaCl，0.05％Tween 20（货号P3563）
4. 捕获或包被抗体
5. 用于标准曲线的对照抗原
6. 标记的检测抗体
7. 底物。通常使用最敏感的底物（例如使用过氧化物酶作为酶标记时，则为TMB或OPD）。
8. 终止液（可选）
9. 微量滴定板
10. 酶标仪
    

操作流程

• 捕获抗体的包被
  
• 对照和样品的结合
  
• 检测抗体的结合

注意：提供的步骤为通用的方法。捕获抗体、样品、对照和检测抗体的最佳稀释度以及孵育时间需要凭经验确定，可能需要大量的滴定实验。理想情况下，可以使用本方案中所描述的酶标记的检测抗体。但是，如果检测抗体未标记，则二抗不能与包被抗体或样本发生交叉反应。也应包括合适的阴性和阳性对照。

捕获抗体的包被

1. 在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液或PBS中适当稀释捕获或包被抗体。捕获抗体通常以0.2至10μg/ ml铺板。 优先选用使用亲和纯化的抗体或至少IgG部分使用亲和纯化。
2. 按每孔0.2ml将稀释的捕获抗体加入到微量滴定板的每个孔中。
3. 37°C孵育1小时（需完全覆盖）。
4. 去除包被液，用洗涤缓冲液（PBS-T）洗涤平板3次。

对照和样品的结合

1. 将0.2ml适当稀释的样品和对照加入相应的孔中。通常，样品在PBS中以10ng-10μg/孔的范围稀释（测定越敏感，需要的样品越少）。
2. 室温孵育平板1小时。
3. 去除样品或对照溶液。用洗涤缓冲液（PBS-T）洗涤平板3次。

检测抗体的结合

1. 稀释酶标记的检测抗体。
2. 每孔加入0.2ml适当稀释的检测抗体。
3. 室温孵育平板30分钟。
4. 去除检测抗体溶液。用洗涤缓冲液（PBS-T）洗涤平板3次。
5. 加入合适的底物溶液。
6. 让平板显色（通常30分钟）并添加终止溶液（可选）。
7. 在酶标仪上以适当的波长读取吸光度。