NBT实验方案和故障排除

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实验方案

与BM Purple（或通常的NBT/BCIP）组合的可能复染剂：

存在有多种可与BM Purple（或通常的NBT/BCIP）组合的复染剂，包括FastGreen FCF和Nuclear Fast Red。

关于用于原位杂交的NBT/BCIP或Fast Red首选底物的建议：

推荐Fast Red用于高表达基因以及进行双标记实验时。如需更多NBT/BCIP与Fast Red双标记结合其它荧光底物的相关信息，请访问http://www-biology.ucsd.edu/~davek/intro.htmL

使用NBT/BCIP通过荧光显微镜进行ISH检测：

用NBT/BCIP染色的玻片通常都是用光学显微镜查看的。根据复染剂，您还可用使用配置有紫外灯源的显微镜进行信号可视化。使用暗视场照明也可以更轻松地检测到非常微弱的信号。

请注意，NBT/BCIP像Fast Red染料一样并不是荧光沉淀物，其可以吸收和发射特殊波长的光。如果您对使用荧光信号感兴趣，请将DIG / AP与ECF底物系统结合使用，而非NBT/BCIP。

显色反应过夜：

将显色反应留过夜是较常见的比较方便的做法。是否需要更长时间取决于探针和组织类型。首先根据经验判断一下，过夜培养是否适用于你的特异性探针和组织。良好的反应后洗涤也是很重要的。当进行过夜显色反应时，要确保你的染色缸密封，放置在黑暗中。NBT/BCIP对空气敏感，在有气泡时，会形成非特异性沉淀。一定要检查缸内玻片间是否有气泡，小心地去除气泡。

ISH中使用过期的NBT/BCIP效果：

当NBT/BCIP过期后，它的灵敏度可能降低，无法进行ISH检测。请准备新鲜的NBT和BCIP，以保证最高的检测灵敏度。

与抗-DIG-AP检测/NBT/BCIP组合的非放射性原位杂交的推荐复染剂：

一个众所周知的现象是NBT/BCIP与经典的复染剂不兼容。NBT/BCIP信号不可以用含二甲苯的封片剂进行封片，因为这会导致颜色沉淀物形成结晶。遗憾的是，经典的复染剂，如伊红，都需要含二甲苯的封片剂。

以下固封剂专门用于NBT/BCIP信号封片：Biomedia公司的Crystalmount或Vector实验室的Vectamount或Immunomount。这些公司还提供与这些封片剂兼容的有机复染剂（例如Vector Methyl Green、Vector Nuclear Fast Red）。将特定的复染剂与任何封片剂组合在一起的结果主要取决于用于NBT/BCIP颜色检测的组织类型。

使用一种典型复染剂给邻近的含有或者不含有NBT/BCIP的片子都染上色，然后用经典的含二甲苯固封剂封片。这样就能直接比较被染色的组织有还是没有信号。

客户推荐制备固封剂实验方案：

甘油明胶：

• 100 mL的0.2 M pH 7磷酸缓冲液；
• 200mg叠氮化钠；
• 15g明胶，搅拌至完全溶解；
• 甘油100 mL。

37℃保存，在载玻片和载玻片与盖玻片接触的边缘滴以上混合物，以保证完全不接触空气。固封剂变硬后，信号能够保持几年，不会发生NBT/BCIP沉淀褪色。

*注: 客户推荐实验方案是客户实验室研发，并未得到Roche验证。Roche不保证方案内容和实验成功。Roche主页上展示的客户实验方案只是Roche协助科研团体经验分享。

防止石蜡包埋组织中强特异性信号丧失：

为了最佳效果，在NBT/BCIP检测后再进行全固封胚胎后固定。

建议：在PBS缓冲液中使用3%的多聚甲醇，再加入1%戊二醛。这能避免信号在以后的步骤比如石蜡化，切片等过程中减弱。没有固定-显色信号消减最多的步骤就在乙醇冲洗，特别是70%乙醇冲洗步骤。可以使用二甲苯。在固封切片时，推荐有机固封剂，比如 M-Glas^®，Paramount，Euparal。

故障排除

棕紫色而不是蓝色信号

在原位杂交实验中，NBT/BCIP沉淀信号变化可以从蓝色到棕色、紫色不等。最终的颜色主要取决于组织中目标MRNA丰度，不过也受到探针长度和标记强度影响。检测溶液pH（碱性磷酸酶反应缓冲液）也有一定影响，要仔细调到pH9.5。

一般来说，目标RNA丰度越高，响应信号越强，颜色沉淀为更深的蓝色。如果想要更深的蓝色或紫色信号，可以尝试我们BM紫底物。

信号弱

如果探针在凝胶和/或斑点分析中已经被评估过了，那么它应该在northern杂交中也能正常工作。如果ISH检测信号弱，可以优化组织切片质量，全固封制备以及检测过程：

• 测试不同的探针浓度：测试在杂交混合液中加入更多的探针：比如每50μl杂交溶液中，在50μl 稀释标准反应溶液中1,2,4,8μl 探针。
• 实验中包含一个强阳性对照
• 测试另外一个使用氯仿而不是蛋白酶K，甘油的实验方案。
  

测试不同的标记实验方案也可能有帮助。

注意：对于DIG原位杂交，很重要的一点是在预处理步骤后以及杂交步骤前，不能让片子变干。片子变干会导致非特异性背景。

心脏样本ISH检测，使用碱性磷酸酶（NBT/BCIP）检测的非特异性“小泡”蓝色背景：

心脏和其他组织中可能会积累细胞内脂滴。当在冰冻切片上使用碱性磷酸酶（NBT/BCIP）检测时，一些颜色沉淀会沉积在这些脂滴中。在预杂交前，氯仿切片去脂（10分钟常温），可以解决这个问题。

使用正常的碱性磷酸酶（NBT/BCIP）检测后普遍蓝色背景：

使用NBT/BCIP产生非特异性背景可能是组织的过固定造成的。这通常会导致整个组织被染成一片蓝色。这可能无法避免，因为你使用的组织来源无法改变，这种背景不应干扰产生特异性信号。这种背景应该不会干扰产生特异性信号。

NBT/BCIP检测缓冲液，有很多沉淀的深蓝色

检查检测缓冲液的pH值，必须是pH9.5，20℃，尽量避免检测液和空气接触（使用染色缸）。检查浓缩NBT/BCIP储存液中是否有沉淀。当显色底物溶液中出现沉淀，将溶液加热到50℃就能够去除沉淀。如果沉淀没有溶解，使用前将管子离心，因为沉淀可能导致背景出现。离心不会降低总灵敏度。

防止原位杂交实验DIG NBT/BCIP信号褪色的建议：

原位杂交后，通常不会发生NBT/BCIP褪色。通常褪色发生在荧光ISH。请注意NBT/BCIP信号玻片不可以用基于二甲苯的固封剂，因为这会导致颜色沉淀结晶。

切片边缘非特应性背景：

• 确保切片在检测过程中没有变干。除了检测过程可能导致这种背景，其他步骤也可能导致这一问题，比如杂交过程。
• 确保杂交过程中，切片被预杂交/杂交缓冲液完全覆盖。这些步骤中切片变干或体积减少可能是潜在原因。
  

为了达到最好的效果：

• 确保杂交用的盒子是完全封闭的。
• 在潮湿杂交盒中操作，杂交盒里需要有和杂交缓冲液中缓冲液和甲酰胺浓度相同的溶液。
• 在切片上盖上盖玻片，或者使用更为方便的封口膜。