PARP1酶活性检测

简介
聚（ADP-核糖）（PAR）是ADP-核糖的聚合物，以游离状态或作为许多底物上谷氨酸残基的翻译后修饰存在于细胞核中。 PAR的合成和降解受到高度调节，其存在介导DNA修复，染色质结构，细胞周期和细胞死亡。 聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）家族通过裂解NAD+和释放烟酰胺来催化将ADP-核糖部分添加到底物蛋白上。 在人类中，PARP家族由17个成员组成，成员的结构和生物学功能差异很大。 PARP1在DNA损伤修复，特别是碱基切除修复中起关键作用。它通过DNA链断裂而被激活，从而使PAR添加到自身和组蛋白上，从而导致PAR结合DNA修复因子（例如XRCC1）募集到损伤部位。 在DNA损伤修复中，PARP2在功能上与PARP1重叠，但PARP2在精原细胞、脂肪组织和胸腺组织的发育中起着与PARP1不同的作用。 PARP家族的其他成员的特征较少，某些成员可能作为单（ADP-核糖基）转移酶起作用而不是聚合酶。 因此，提出了一种新的命名法，该命名法是指成员的共同ADP-核糖基转移酶活性。

已经开发了许多PARP1抑制剂来阻止化疗药物诱导的遗传毒性损伤的修复，从而增强化疗药物在癌症患者中的细胞毒性作用。 PARP1的抑制作用似乎与化学疗法联合使用对在同源重组DNA修复途径（主要是BRCA1和BRCA2）的成分中具有突变的癌症细胞特别有效。 PARP抑制剂也正在临床试验中进行评估。

最常用的PARP活性测定法采用生物素化NAD+作为PARP的底物，将生物素-ADP-核糖掺入固定化组蛋白底物上的PAR链中。 用链霉亲和素-HRP测定生物素-ADP-核糖的掺入量。

该技术的缺点包括：
1）作为底物的非天然NAD+类似物可能产生与未修饰的NAD+不同的动力学。
2）蛋白质/肽底物缺乏灵活性
3）多个耗时的洗涤步骤。

为了克服这些障碍，EMD Millipore’s PARP1酶活性测定利用荧光偶联酶法进行烟酰胺降解，以允许使用天然NAD+底物并具有肽/蛋白质受体底物的灵活性。

EMD Millipore′s PARP1酶测定法是一种灵活可靠，均相，无洗涤的测定法，用于定量PARP1 & PARP2活性。 基于一种新的正在申请专利的技术，这种易于执行的测定法使用烟酰胺酶来测量在底物的PARP介导的聚ADP-核糖基化过程中NAD+裂解后产生的烟酰胺（见图1），从而提供了PARP1 & PARP2活性的直接阳性信号评估。
为了进行该测定，将PARP酶，β-NAD，活化的DNA，测试化合物和重组烟酰胺酶合并，并孵育30分钟。在孵育过程中，激活的DNA触发PARP1或PARP2产生聚（ADP-核糖）和烟酰胺。 在次级反应中，烟酰胺酶将烟酰胺转化为烟酸和NH3+（游离氨）。 为了产生读出信号，加入专有的显影剂试剂，并使用荧光酶标仪读取信号。
该试验的稳健性能使其适用于测量PARP1和PARP2活性以及筛选PARP酶的激活剂和抑制剂。

研究类别
细胞凋亡 & 癌症

该PARP1酶测定法是一种灵活&可靠，均相，无洗涤的测定法，用于定量PARP1 & PARP2活性。

黑色96孔板-1个板
PARP1分析缓冲液-4 mL
板盖-2个板盖
活化的DNA-1小瓶（100 µg，10 mg/mL）
β-NAD-1小瓶（30 µL，50 mM）
烟酰胺（NAM）-1小瓶（10 µL，10 mM）
重组PARP1酶-1小瓶（2 µg，0.2 µg/µL）
重组烟酰胺酶与50%甘油-1小瓶（60 µg，1 mg/mL）
DMSO中的3-ABA（PARP抑制剂）-1小瓶（300 µL，100 mM）
显影剂-4 mL，10 mM。

将未拆封的试剂盒保存于-80ºC。未使用的组分应储存在-80ºC。 当正确储存时，该试剂盒在接收之日起可稳定保存4个月。如果首次使用后需要组分，应通过等分方式避免重复冻融循环。

CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany

除非我们的产品目录或产品附带的其他公司文档另有说明，否则我们的产品仅供研究使用，不得用于任何其他目的，包括但不限于未经授权的商业用途、体外诊断用途、离体或体内治疗用途或任何类型的消费或应用于人类或动物。