如何优化 Duolink^® 邻位连接实验

要成功地执行 Duolink® PLA 实验，实验方案中有一些必要的考虑因素需要正确地准备、设置和执行。Duolink® PLA 产品可用于荧光和明场。荧光 Duolink® PLA 试剂可用于显微镜和流式细胞术应用。

• 实验设计
• 选择读出方法
• 实验准备

实验设计

要设计一个成功的Duolink^® PLA实验，必须考虑很多因素。这些因素包括但不限于：

• 确定蛋白质靶标和实验类型
• 选择样品（细胞或组织）
• 设计您的读出方案
• 设计实验对照（技术和生物）

靶标识别

首先要确定的是目标蛋白靶标。是单一蛋白质表达，蛋白质与蛋白质的相互作用 (PPI)，还是蛋白质翻译后修饰 (PTM)？下面简要介绍了 Duolink^® PLA 如何用于检测各种类型的蛋白靶点。

单一蛋白表达的检测

检测单个蛋白靶标有两种方法，即使用针对靶标的一种一抗进行单一识别或两种一抗进行双重识别。

蛋白质与蛋白质的相互作用检测

Duolink^® PLA是检测蛋白质相互作用的绝佳方法。该方法使用两种一抗来完成，每种抗体针对一种目标靶标，且在不同物种（小鼠、兔或山羊）中培养。两种一抗必须在相同的实验条件下与靶标结合。

蛋白质与核酸的相互作用检测

蛋白质-DNA 和蛋白质-RNA 相互作用也可以通过使用修饰的原位杂交技术结合Duolink^® PLA来进行检测。有关使用 Duolink^® PLA 检测蛋白质-DNA 或蛋白质-RNA 相互作用的详细信息，请参阅参考文献。

样品选择

对样品和蛋白质靶标的已有了解十分重要。选择具有已知靶蛋白表达的系统将显著增加Duolink^® PLA实验成功的几率。

Duolink^® PLA实验所需的样本与用于传统免疫荧光 (IF)、免疫组织化学 (IHC) 或流式细胞术的样本相同。因此，Duolink^® PLA试剂适用多种样品类型，包括：

• 贴壁细胞
• 悬浮细胞
• 血细胞
• 细胞离心涂片制剂
• 石蜡包埋细胞样品
• 石蜡包埋组织切片
• 冰冻组织切片
• 新鲜组织切片

在进行 Duolink^® PLA 实验之前，必须对所有样品进行固定。对于流式细胞术应用，需要使用悬浮细胞。

选择读出方法

Duolink^® PLA产品提供了荧光和明场版本选择。荧光 Duolink^® PLA 试剂可用于显微镜和流式细胞术应用。

选择读出方法的关键考虑因素是专用设备的可用性。荧光显微镜是 Duolink^® PLA 实验最常用的读出设备。上述所有样品类型均可与荧光Duolink^® PLA 试剂一起使用，不过，部分样品会表现出明显的自发荧光。如果发生这种情况或当荧光仪器不可用时，可用光学显微镜进行明场Duolink^® PLA实验。

流式细胞术方案对于仪器类型是不可知的（假设实验设计所需的合适滤光片可用），并且较易于适用于贴壁或悬浮细胞。

实验对照

Duolink^® PLA 结果为蛋白质事件（表达、相互作用或修饰）提供了相对定量。因此，加入技术对照组，以及在可能的情况下加入生物对照组，是十分重要的。

技术对照

每个 Duolink^® PLA 实验中应该包含两个技术对照组。这包括：

• 分别省略一种一抗
  • 用于检测每种一抗的非特异性结合
  • 有助于确定最佳一抗效价
• 省略所有一抗
  • 用于检测系统中 Duolink^® PLA 探针的非特异性结合

生物对照

除了技术对照外，强烈建议使用生物对照。阳性和阴性生物对照均可提供有价值的信息。

• 阳性对照
  • 用含已知蛋白表达、相互作用或修饰的单独样本来测试试剂
  • 可诱导系统（如生长因子刺激、热休克等）的使用将提供Duolink^® PLA信号的生物学相关性
• 阴性对照
  • 使用不表达蛋白质靶标的样品（例如敲除、沉默等）将提供一抗特异性的信息
  • 使用不相关抗体（例如同种型 IgG、非相互作用蛋白的抗体等）将提供关于Duolink^® PLA 探针特异性的信息
  • 使用阻止蛋白质相互作用或修饰的抑制剂将提供 Duolink^® PLA 信号的生物学相关性  

实验准备

为确保成功执行 Duolink^® PLA 实验，需要进行大量准备工作。这些准备工作与传统的 IF、IHC 或流式细胞术所需的工作类似。本节描述了一抗鉴定、样品制备和抗体优化的注意事项。

一抗的选择

Duolink^® PLA试剂是使用二抗进行靶标特异性一抗检测的通用试剂。设置 Duolink^® PLA 实验时，一抗的选择至关重要。

要求

Duolink^® PLA探针是驴抗小鼠、抗兔或抗山羊二抗；因此，对一抗有特定要求。这包括：

• 宿主必须是小鼠、兔子或山羊（特例情况要求使用Duolink^® Probemaker）
• IgG 类
• 可以是单克隆或多克隆
• 优选亲和纯化以使交叉反应性最小化
• 建议使用 IF 或 IHC 验证

直接偶联一抗的使用

有些情况下需要使用直接偶联的一抗。Duolink^® Probemaker能够将 PLA oligo (PLUS 或 MINUS) 偶联到任何抗体上。使用 Duolink^® Probemaker 的注意事项如下：

• 当一抗的宿主不是小鼠、兔或山羊时
• 当使用来自同一物种的两种一抗时
• 当使用在与组织样品相同的宿主中产生的一抗时（例如，“小鼠一抗检测小鼠样品”）

一抗优化

为了成功执行 Duolink^® PLA 实验，确定待测样品中最佳一抗性能的条件非常重要。一抗优化的条件应包括：

• 样品处理（固定、透化和抗原修复）
• 一抗浓度
• 阻断溶液和抗体稀释剂

下面介绍样品处理、阻断和抗体稀释剂的具体注意事项。强烈建议首先通过 IF 或 IHC 染色鉴定一抗的条件。当使用两种一抗时，每种一抗的优化应分开进行，但样品处理需要兼容两种一抗的最佳性能。

一旦 通过IF 或 IHC 确定了条件，这些条件就可以应用于 Duolink^® PLA。但是，Duolink^® PLA 实验可能需要进一步滴定一抗浓度，因为与 IF 和 IHC 相比，Duolink^® PLA 具有更高的灵敏度和更放大的信号。使用上述Duolink^® PLA单一识别方法可在优化一抗浓度时提供最高的灵敏度。这些条件可用于使用两种一抗的 Duolink^® PLA 实验。

样品处理

样品应在固定、透化和抗原修复方面进行适当的处理。实验中所用一抗的条件优化对检测性能至关重要。

固定

固定过程用于固定抗原，同时保留细胞和亚细胞结构。固定剂的选择可根据样品类型（细胞或组织）、一抗和蛋白靶标的不同而不同。不同的固定剂可影响一抗的抗原性，从而影响一抗的性能。如果所选一抗没有推荐固定方法，则必须由用户进行优化。

Duolink^® PLA试剂与 IF 和 IHC 的所有常用固定剂兼容，包括：

• 丙酮
• 乙醇
• 甲醛
• 甲醇
• 多聚甲醛
• 锌

透化

抗体进入细胞内表位需要透化作用。这通常是通过 Triton X-100、NP-40、Tween-20 或 digitonin等去垢剂来实现。有许多去垢剂可供选择——使用一种最适合固定和所用样品的去垢剂。值得注意的是，一些固定剂（如丙酮和甲醇）也会引起透化，因此可能不需要额外的透化步骤。

抗原修复

抗原修复用于显示在固定过程中被掩盖的抗原表位，从而允许抗体结合。抗原修复最常用于福尔马林固定的石蜡包埋 (FFPE) 样品，但有时也用于悬浮固定的细胞。不同的抗原修复方法可能影响一抗的性能，因此必须由用户进行优化。

两种主要方法是热诱导抗原修复法 (HIER) 和酶诱导抗原修复法 (PIER)。Duolink^® PLA 与 IHC 的常用抗原修复缓冲液兼容，包括：

• HIER：Trilogy™、柠檬酸盐、EDTA 和高 pH Tris
• PIER：用蛋白酶 K、胃蛋白酶和胰蛋白酶处理

封闭液和抗体稀释剂

Duolink^®封闭液和抗体稀释剂含有 Duolink^® PLA 探针（PLUS和MINUS）。这些溶液已进行优化，可与Duolink^® PLA试剂配合使用，以最大限度地减少抗体和检测寡核苷酸的非特异性结合。然而，在这些条件下，必须验证您的一抗与目标蛋白靶标的特异性结合。应通过 Duolink^® PLA 单一识别实验，或者 IF 或 IHC 来分别检测每种一抗。

如果您之前已经确定了用于IF 或 IHC 染色的封闭液和/或抗体稀释剂，则这些溶液很可能也可用于 Duolink^® PLA。在这些溶液中不应该使用来自与您的一抗相同物种的同种型 IgG 作为封闭液，因为这将导致来自 Duolink^® PLA 探针的错误信号。

附录

反应体积

为获得理想的结果，应根据反应面积调整反应体积。1 cm²面积对应于40μl 反应体积。请根据您的反应面积调整反应体积。总反应体积切勿小于 15μl。