上游种子制备工艺是生物制剂生产的准备环节，对其进行优化可改进生产效率、提高生产力以及降低生产成本。然而，现有的上游设备和/或基础设施会制约工艺强化而限制效率改进，能达到的最高种子细胞密度也限定了分批补料生产生物反应器能达到的最高生产力。有一种策略可以提高现有分批补料生产生物反应器的产量，即在N-1生物反应器中采用灌流技术提高种子制备的最终生物质含量，使分批补料生产生物反应器能够接种的细胞密度远超传统分批补料制备工艺。
本应用说明描述了Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基的优势和性能，这款培养基专门开发用于从细胞复苏到N-1阶段的多个种子细胞扩增步骤，以产生更多生物质接种分批补料生产生物反应器。文中出示4种中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株在该扩增培养基中生长的倍增时间、活力和活细胞密度数据，证明该现货即用型产品在这一应用的可行性。 从该培养基转向我们生产阶段的某种培养基平台时，也无需驯化细胞或确认相容性。
图 1.标准生产工艺与N-1灌流式种子制备工艺的比较
N-1灌流培养和N-1专用扩增培养基的优势
种子制备（seed train，种子扩大培养）是放大培养细胞得到足够的细胞密度以便接种生产生物反应器的必需环节。一直以来，种子制备严重依赖分批或分批补料工艺，其中细胞随着几次体积扩大过程而增殖积累，然后用于接种生产生物反应器。这些工艺方法由于培养容器容量较小，以及传统补料策略提供的营养有限使细胞生长受限，导致最终能达到的种子密度也相对有限。 在N-1步骤采取灌流培养和专用的Cellvento® 4CHO-X 扩增培养基，可积累更多的生物质，从而让分批补料生产生物反应器能够接种的细胞密度达到传统N-1步骤的5-15倍（图1）。这里比较重要的一点是，应采用仍然处于指数生长期的细胞接种N阶段的最终生物反应器。
Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基专门用于CHO细胞系的种子扩增和N-1灌流培养，支持细胞在N-1生物反应器的高密度和高活力生长，最终提高用于生产生物反应器接种的细胞生物质含量（图2）。这款扩增培养基以最优的营养物质浓度比例配制而成，可实现高细胞密度下的低细胞比灌流速率(CSPR)。培养基化学成分确定、无动物源成分，且不含任何水解产物或未知成分或多变组分。培养基经过特别调配以控制细胞在灌流操作模式下的代谢表现，既能尽量减少抑制性副产物，又能保证充足的营养水平以支持高密度细胞培养。
图 2.(A)某生物反应器接种0.5 x 106个活细胞/mL密度的CHOZN® GS细胞株，并以分批培养模式在Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基中生长约3天。之后，改用添加葡萄糖的Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基开始灌流培养（灌流速率vvd-1）。(B) 活细胞密度(VCD)的对数图表明N-1灌流生物反应器中的细胞维持在指数生长期。
Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基的性能
本研究采用常用的CHO细胞亚型（CHO-GS、CHO-K1-GS和CHO DG44） 证明Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基具有广泛的应用性。细胞株先在Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基中培养，然后以300,000细胞/mL密度接种30 mL工作体积到TPP离心管中。离心管放到37 °C振荡培养箱中培养，设5% CO2，80%湿度，25 mm振幅，320 rpm转速。细胞培养3或4天后进行传代。
图3显示CHOZN® GS-/-克隆（CHOZN-GS 1和CHOZN-GS 2）与其他两种常用生产细胞株（CHO-K1-GS和CHO DG44）在Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基中生长第4天的倍增时间(A)，第4天活力(B)和活细胞密度(C)。在培养第4天，所有4种细胞株都显示一致的倍增时间、活力和活细胞密度。表1显示同一细胞株在第3和第4天的倍增时间没有显著差别。
图 3.4种CHO细胞亚型在Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基中生长的(A)第4天倍增时间，(B)第4天活力和(C)第4天活细胞密度。
表1.各种CHO亚型细胞在Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基中的生长特性。
采用N-1灌流培养时，一个需要重点考虑的因素是，N-1灌流生物反应器中的培养基会与N-阶段所用培养基有所差别。这种情况最好采用不需要进行驯化的相容性培养基。Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基设计用于种子制备的整个扩增流程，与我们的EX-CELL®和Cellvento®分批补料和灌流生产培养基相容。这一便利性免除了细胞驯化以至相容性检查的需要。Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基得以免除转向生产步骤时大量耗费时间和资源的驯化步骤，即若采用Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基制备种子库，从细胞复苏进展到生产流程，中间不用再进行培养基驯化。
Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基与分批补料平台Cellvento® 4CHO/4Feed培养基和EX-CELL® Advanced分批补料培养基的相容性研究如图4所示。鉴于不同的CHO细胞亚型具有不同的生长特性，我们选用多种细胞株进行评估，以便更全面地分析Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基的施用效果。此图中，两种CHO细胞株的扩增步骤或采用这些平台的Cellvento® 4CHO培养基和EX-CELL® CD Fusion培养基，或采用Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基。
采用Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基的扩增条件在图4中以虚线表示；采用传统基础培养基（基线对照）的扩增条件以实线表示。在Cellvento® 4CHO平台中，扩增培养基具有显著的滴度升高效果；在EX-CELL® Advanced分批补料平台中，Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基对两种克隆的培养效果相当。这些结果表明，Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基可与Cellvento® 4CHO培养基或EX-CELL® Advanced分批补料培养基共同用于最终生产步骤。滴度(IgG)水平随几种细胞株种类和培养基条件而变化，反应出某些细胞株对培养基的配方更加敏感。
图 4.扩增培养基与Cellvento® 4CHO培养基和EX-CELL® Advanced CHO分批补料培养基的相容性。列出的第一种培养基代表所用的扩增培养基，第二种培养基代表所用的分批补料培养基。(A)CHO DG44亚型的活细胞密度。(B)CHOZN® GS亚型的活细胞密度。(C)CHO DG 44亚型的IgG滴度。(D)CHOZN® GS亚型的IgG滴度。
图4所示TPP离心管结果接着在1 L生物反应器中进行确认（图5）。测试Cellvento® 4CHO平台与Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基在不同条件下的相容性。紫色条件为细胞在Cellvento® 4CHO培养基中扩增；黄色条件为细胞在Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基中扩增。经不同条件的种子扩增后，将所得细胞培养物接种分批补料生产生物反应器，采用Cellvento® 4CHO分批补料平台进行生产。虽然两种条件产生的细胞生长和活力特性相似，但在滴度上，种子扩增步骤采用Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基的显著高于Cellvento® 4CHO培养基。
图 5.生物反应器确认与Cellvento® 4CHO分批补料平台的相容性，显示有36%的滴度提升。
本研究可证明（Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基）与我们的EX-CELL®和Cellvento®分批补料和灌流生产培养基产品具有相容性。而为了评价其对N-1应用本身的增益，采用Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基运行N-1生物反应器。该生物反应器接着用于接种生产生物反应器，使用EX-CELL® Advanced培养基与50:50混合的EX-CELL® Advanced Feed 和Cellvento® 4Feed培养基，采用两种接种密度。Mobius®生物反应器（3 L，工作容量1.5 L）分别以低(0.5 × 106 cells/mL)或高(5.0 × 106 cells/mL)接种密度接种，接着两者以同样的补料方式在分批补料模式下运行。此外，平行运行分批补料生产(N)对照条件，其采用Cellvento® 4CHO-X培养基和摇瓶，通过非灌流的传统种子扩增模式制备细胞，再以低密度(0.5 × 106 cells/mL)接种反应器。每种生物反应器研究条件都进行重复评估。图6所示结果表明：
- 在N-1阶段采用灌流模式没有对Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基中的细胞性能造成负面影响（通过所有评估条件都具有相似的细胞活力和比生产力而证明）。
- 高密度细胞接种的生产(N)生物反应器在整个研究进程中产生明显更高的生物质总量和累积滴度(accumulated volumetric titer)。
图 6.在生产(N)生物反应器中接种低(0.5 x 106 cell/ml)和高(5 x 106 cell/ml)两种细胞密度时，Cellvento® 4CHO-X的细胞培养性能比较。对比的细胞性能参数包括细胞密度(A)，细胞活力(B)，累积滴度(C)和比生产力(D)。
联用N-1灌流培养和Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基制备种子库，并以高细胞密度接种分批补料生产生物反应器，具有以下重要优势：
- 大幅缩短生产生物反应器运行时间（达到最高细胞密度的天数）。
- 通过去掉一个种子制备生物反应器，减少设施足迹，或者，通过采用单个高细胞密度N-1灌流生物反应器接种多个传统的分批补料生产生物反应器，优化现有生产基础设施的利用率和生产力。
结论
上游工艺强化能够提高生产力、加快蛋白质生产和改进现有设施足迹效率。采用灌流工艺，特别是用于种子制备环节，可在依然维持生产生物反应器按更易于操作的分批补料模式运行的前提下，降低生产成本和提高制剂产量。采用Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基的N-1灌流培养支持以更高的细胞密度接种生产生物反应器，最终获得更高的制剂滴度。本研究对CHO细胞系的评估结果证明了对几种CHO细胞亚型采用Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基均兼具工艺稳健性和操作灵活性。
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