分枝杆菌菌种检测和分子鉴定

• 分枝杆菌属的微生物学及特征
• 分枝杆菌分离培养基
• 使用染色技术检测分枝杆菌
• 非结核分枝杆菌
• 分子方法鉴定分枝杆菌菌种
• 分枝杆菌染色产品

分枝杆菌属微生物学及其特征

分枝杆菌属于放线菌目，是分枝杆菌科中唯一的属。目前，分枝杆菌属有超过100个公认或拟议物种，包括众多病原体和温血动物的腐生生物。分枝杆菌细长、不形成孢子、杆状、需氧、生长缓慢，在土壤和水中自由生存。这类细菌的代际间隔约20小时，因此分离和鉴定可能需要长达6周的时间。

按照传统做法，分枝杆菌通过基于培养的表型方法鉴定，例如形态学特征、生长速率、优选生长温度、颜色和一系列生化测试。测试工作费时费力而且困难重重，需要数周才能充分生长，并且有时可能会发生错误鉴别，因为不同的菌种可能具有难以区分的形态和生化特征。有多种不同的培养基用于分离分枝杆菌。最常用的是称为“Löwenstein-Jensen培养基”的蛋类培养基，其含有高浓度的孔雀绿，以克服其他细菌的污染。

分枝杆菌分离培养基

在过去十年中，已经推出几种基于液体培养基的分枝杆菌培养的商业系统。液体培养基经证比分离临床标本分枝杆菌所用的蛋类固体培养基更敏感。结核分枝杆菌是生长缓慢的分枝杆菌，即在初级分离中，它们在培养的第一周内几乎不显示任何可见的生长。在蛋类培养基上，它们产生特征性的无色素菌落，一般具有类似于面包屑的粗糙和干燥外观。在琼脂培养基上，菌落看起来平坦、干燥且粗糙，边缘不规则。结核分枝杆菌是烟酸阳性，被对硝基苯甲酸抑制，并显示出硝酸还原酶活性。其他试验证实，结核分枝杆菌分离株在噻吩甲酰肼 (TCH) 上生长时对吡嗪酰胺敏感，在 68 °C 下不吸收铁和产生过氧化氢酶。

使用染色技术检测分枝杆菌

通过显微镜可直接检测Ziehl-Neelsen染色的分枝杆菌，从而鉴定耐酸杆菌。分枝杆菌细胞壁富含脂质，因而耐受革兰氏染色。此方法也可用于染色几种其他细菌，例如诺卡氏菌。用于染色的试剂有碳酸复红、酸-醇和亚甲蓝。耐酸杆菌染色后呈鲜红色。

非结核分枝杆菌

非结核分枝杆菌（NTM）是普遍存在的生物，常常从环境来源中分离出来，包括地表水、自来水和土壤。与肺病最常相关的NTM菌种是鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和脓肿分枝杆菌。伤口皮肤/皮下感染就是因为分枝杆菌的快速生长造成的。人们普遍认为，偶发分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和龟分枝杆菌由局部环境菌株或受污染的商业外科材料、设备或注射用溶液引起。快速生长的分枝杆菌通常在常规细菌培养基上生长——特别是血琼脂板上——但由于需要较长时间才能形成可见的菌落（长达10天），常规细菌学实验室通常无法检出。此外，NTM还可在大多数分枝杆菌分离培养基上分离。尽管大多数菌种的最适温度为30-32°C，但NTM也会在36-37°C（分离结核分枝杆菌的标准温度）下生长。

分子方法鉴定分枝杆菌菌种

在过去十年中，分子方法的进步使我们可以快速、可靠地鉴定许多分枝杆菌菌种。目前核酸探针、菌种特异性PCR、反向杂交和16S rRNA测序鉴定方法均已经过临床实验室应用评估。首个商业化的鉴定方法是基于菌种特异性DNA探针的AccuProbe（Gen-Probe Inc.），此探针可与rRNA杂交，从而鉴定几种重要的分枝杆菌，包括结核分枝杆菌复合体、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌复合体、堪萨斯分枝杆菌和戈登分枝杆菌。

最近还涌现出了其他用于快速鉴定结核分枝杆菌复合体的商业化分子系统：INNO- LiPA MYCOBACTERIA v2（比利时根特Innogenetics NV）、以及GenoType MTBC和GenoType Mycobacterium（德国内伦Hain Lifesciences）。

• INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2是一种线性探针技术，可同时检测和鉴定分枝杆菌属和16种分枝杆菌菌种。此技术基于16S-23S rRNA基因间隔区中的核苷酸差异。
• GenoType MTBC和GenoType Mycobacterium同样基于反向线性探针杂交技术，分别可分化结核分枝杆菌复合体成员，以及鉴定包括结核分枝杆菌在内的35种分枝杆菌。GenoType MTBC基于对结核分枝杆菌复合体特异的23S rRNA基因片段、gyrB序列多态性、以及用于鉴定牛分枝杆菌BCG的RD1缺失。
• 现还有几种16S rRNA基因测序“内部”技术可作为参考标准，供所有其他新技术大致对比参考。