利用慢病毒成功转导

成功使用慢病毒产品的方法和贴士。

成功靶向有赖关键敏感工艺步骤的优化，包括慢病毒转导。以下是我们的慢病毒研发专家提供的部分实用处理和滴定贴士。和以往一样，如果您对基因组修饰项目存在任何疑问，随时欢迎通过 CRISPR@sial.com 联系我们的技术支持部门。

• 慢病毒转导方案概述
   

关键术语定义：

MOI （感染指数） - 转导慢病毒颗粒数量与细胞数量的比率。
VP（病毒颗粒） - 病毒的胞外感染形式，由蛋白质包膜内的 RNA 或 DNA 核心组成
TU - （转导单位） - 溶液中能够转导细胞并表达转基因的功能性病毒颗粒数量

处理慢病毒：

• 慢病毒对极端温度变化敏感。多次反复冻融及长时间接触环境温度会降低功能性慢病毒滴度。
  
  
• 请在湿冰上解冻慢病毒颗粒。进行慢病毒转导时请将在冰上保存。
  
  
• 第一次解冻慢病毒后，应等分成较小的工作体积。  初次实验未使用的等分样均应立即放回 -70° C。也可订购工作体积等分规格的慢病毒，每次仅解冻转导所需体积的慢病毒。
  
  
• 所有病毒以及任何接触病毒或含病毒细胞的技术设备和吸头均应在10%漂白剂中浸泡 20 分钟，然后丢弃到生物危险废物垃圾箱中。

实验构建优化建议和步骤

• 针对每个细胞系绘制杀灭曲线，确定筛选慢病毒整合细胞所需的最佳抗生素浓度
  
  
• 确定您计划使用的各细胞系和慢病毒载体组合功能滴度（见下文）
  
  
• 确定您计划使用的各细胞系和慢病毒载体组合的感染指数(MOI)。  MOI指的是转导慢病毒颗粒数量与细胞数量的比率。  强烈建议对于要转导的每种新细胞类型，测试一系列MOI。
  
  
  • 将1.6 x10⁴个细胞加入装有120 µL新鲜培养基的96孔板的孔中。
  • 将对照病毒加入一系列 MOI 的细胞中。对于大多数细胞类型，0.1 - 10 MOI即可。对于难转染细胞系，可能需要增大到MOI 50或100。
  • 如果使用抗生素筛选：添加筛选培养基，在最低测试 MOI 值下识别存在活细胞的孔。此即为未来该细胞系和载体转导实验使用的 MOI
  • 如果使用荧光：在最低测试MOI值下识别具有所需可定量荧光团表达的孔。
     
• 计算确定MOI后所需的病毒量：
  • （每个容器或孔的细胞总数）x（所需 MOI）= 所需的总 TU
    
  • （所需的总 TU）/（TU/mL功能滴度）= 每孔加入的慢病毒颗粒总体积(mL)

滴定慢病毒颗粒：

慢病毒制备完成后，需要在转导前测定滴度。我们的慢病毒产品的报告病毒滴度通过 p24 ELISA 测定。此方法可测定慢病毒相关的 p24 衣壳蛋白。

• 我们根据ZeptoMetrix的p24试验确定 TU/mL。我们使用 Didier Trono 转换因子确定 pg/mL p24 和病毒滴度之间的关系：
  
  
• 已知变量：
  1.大约有2000分子的慢病毒p24蛋白/物理颗粒（PP）。
  2.1 Da = 1 g/mol
  3.阿伏加德罗常数 = 6 x 10²³ 个分子/mol
  4.p24 蛋白的分子量为24 x 10³ Da = 24 x 10³ g/mol
  
  
• 等式：
  (2000 分子/PP) ● (24 x 10³ g/mol)= 48 x 10⁶ g ● 分子 / PP ● mol
  
  (48 x 10⁶ g ●分子 / PP ● mol) ÷ (阿伏加德罗常数) =
  (48 x 10⁶ g ● 分子 / PP ● mol) ÷ (6 x 10²³ 分子/mol) = 8 x 10^-17 g/PP
  
  四舍五入后，8 x 10^-17 g/PP ≃ 1 x 10^-16 g/PP
  
  将g/PP转换为pg/PP：(1 x 10^-16 g/PP) ● (1 x 10¹² pg/g) = 1 x 10^-4 pg/PP
  
  求逆：
  如果1 x 10^-4 pg = 1 PP； 求逆后1 pg = 1 x 10⁴ PP
  
  因此，1 pg p24 蛋白含有大约 10,000 PP

递送构建体（也称为转运载体）包膜成慢病毒颗粒的效率可能因转运载体的大小和组成而存在很大差异。  因此，合理包膜的 VSV-G 假型慢病毒载体对于低效转运载体的感染性范围为每 200 个病毒颗粒 1 TU，100% 有效病毒包膜时，感染性范围为每 1 个病毒颗粒 1 TU。需要注意的是，重组慢病毒的功能滴度测量不仅取决于转运载体的包膜效率，还取决于所用细胞系的转导效率。

• 定制和标准慢病毒制剂均附有质检报告(COA)，以转导单位/mL (TU/mL) 形式标示 p24 滴度。
  
  
• 通过96孔形式（小规模）生产时，我们的慢病毒载体产量在 1x10⁶至 1x10⁷ TU/mL 之间（p24 ELISA法测定）。
  
  
• 更高滴度和体积（大规模）可选。可选滴度范围为1x10⁷至1x10¹⁰ TU/mL（p24 ELISA法测定），可选体积范围为 0.1 mL 至 10 mL。注意：并非所有体积选项均可提供最高滴度。
  
  
• p24 和功能滴度之间的相关性具有载体和细胞系特异性。每次转导实验开始时，首先确定待用胞系中每种载体的 p24 滴度和功能滴度之间的关系。测定功能滴度的常用方法包括：
  • 用于生成菌落形成单位的有限稀释方案（CFU测定）
  • 荧光激活细胞分选 (FACS) 滴定
  • qRT-PCR
  • 详情请见慢病毒实验方案页面
     
• 我们提供各种标准对照和定制对照，旨在优化实验构建并确定 p24 滴度和功能滴度之间的关系。确定每一细胞系和载体的 p24 与功能效价之间的相关性后，可将此相关性用于同载体和细胞系的其他实验。