凋亡分析检测
基于细胞的凋亡检测方法
凋亡或程序性细胞死亡是一种限制生长的调节机制，细胞通过该机制响应由不可修复的细胞或DNA损伤导致的细胞外信号，进而引发细胞自身死亡。肿瘤细胞逃避凋亡的能力是大多数癌症的标志。凋亡在发育机制中也具有重要作用，例如防止正在发育的大脑中神经元细胞谱系的过度生长和调节肢体发育中的指间间距。自噬与细胞凋亡相关，两者之间具有广泛的关联。例如，在营养缺乏期间，自噬作用是一种生存机制。但是，过度自噬可能会导致细胞死亡，这一过程在形态上不同于凋亡。凋亡是包括早期、中期和晚期细胞事件的多步骤过程，可以使用各种细胞测定法检测，包括下文所述的膜联蛋白V、Caspase和TUNEL检测方法。
凋亡的阶段
早期事件：磷脂酰丝氨酸向细胞膜外叶易位（1），线粒体膜电位丧失（2），细胞色素C和ATP释放（3）以及caspase-8和9的激活（4）。
中期事件：caspase-3、6和7的激活（5），Poly-ADP-核糖聚合酶（PARP）裂解（6），细胞皱缩（7）和核酸酶激活（8）。
晚期事件：DNA片段化（9），细胞核崩解（10），凋亡小体形成（11）和巨噬细胞吞噬（12）。
早期凋亡
膜联蛋白V检测法：磷脂酰丝氨酸通常被限制在活细胞的内膜小叶中。磷脂酰丝氨酸向暴露的细胞膜表面易位是细胞凋亡的早期事件，该事件是细胞凋亡中吞噬细胞攻击的信号。膜联蛋白是可以与细胞膜发生特异性结合的结构相关蛋白家族。膜联蛋白V对含有带负电荷的磷脂磷脂酰丝氨酸的膜具有非常高的亲和力，可以用作早期凋亡事件的标记物。
图 1.点阵图描绘了使用各种浓度的凋亡诱导剂处理并使用Annexin Red Kit膜联蛋白试剂盒（FCCH100108）染色的Jurkat细胞。不处理（图A）或用0.1 uM（图B）或3 uM星形孢菌素（图C）处理Jurkat细胞，然后使用FlowCelllect Annexin Red试剂盒染色。
线粒体检测：线粒体是重要的细胞器，可维持至关重要的细胞能量平衡，含有细胞死亡过程（如凋亡）的关键调节剂，并在细胞氧化应激的产生中发挥重要作用。线粒体膜电位消失被认为与线粒体外膜的透化作用以及细胞色素C和其他促凋亡蛋白释放到细胞质中有关，这些事件进一步引发凋亡级联反应的下游事件。
中期凋亡
Caspase检测法：凋亡过程的主要组成部分是一系列蛋白水解酶，它们被称为半胱天冬酶（caspase）。半胱天冬酶参与一系列由促凋亡信号触发的反应，并导致蛋白质底物的裂解，从而引起细胞分解。 半胱天冬酶能够特异性识别靶标底物上的4或5氨基酸序列，其中必然包括天冬氨酸残基。该残基是发生裂解的靶标，其发生在天冬氨酸残基的羰基末端。
使用CellASIC® ONIX2微流体系统对免疫细胞凋亡进行活细胞成像
图 2.MCF-7乳腺癌细胞的线粒体膜电位、caspase活性和凋亡的活细胞检测。不处理MCF-7细胞（86012803）（A）或使用星形孢菌素（S5921）处理MCF-7细胞过夜以诱导凋亡（B），然后使用 BioTracker™ 405蓝色线粒体染料（SCT135）、BioTracker NucView® 530红色 Caspase-3 染料（SCT105）和 CF®488A 膜联蛋白V在细胞培养基中于37°C染色30分钟，无需清洗。健康细胞显示出线粒体染色（青色），凋亡细胞失去蓝色染色（青色），并显示出细胞核染色（红色）和细胞膜CF®488A 膜联蛋白 V染色（绿色）增加。
晚期凋亡
TUNEL 检测法：细胞凋亡中的DNA片段化通常与细胞形态的结构变化有关，是晚期细胞凋亡的标志。凋亡中的DNA片段化可以使用TUNEL检测法进行检查。使用TUNEL检测法原位染色检测DNA链断裂并通过光学显微镜进行观察，可获得关于DNA损伤和晚期凋亡的生物学重要数据。
图 3.ApopTag™ 细胞凋亡试剂盒系列利用TUNEL检测法检测DNA片段化。采用修饰核苷酸标记游离3’-OH端基，从而检测出DNA链断裂。DNA片段化产生的这些新的DNA末端通常位于形态可识别的细胞核和凋亡小体中。
图 4.A)使用ApopTag®过氧化物酶（S7200）检测人淋巴结中的凋亡细胞。使用10％中性缓冲福尔马林固定组织并使用石蜡包埋。B)使用ApopTag®荧光素原位凋亡检测试剂盒（S7160）检测小鼠胚胎前肢芽中的凋亡细胞，使用10％中性缓冲福尔马林固定组织并使用石蜡包埋。C)使用ApopTag®红色原位凋亡检测试剂盒 (S7165) 检测人淋巴结组织中的凋亡细胞，使用10％中性缓冲福尔马林固定组织并使用石蜡包埋。
H2A.X 检测法：产生双链DNA断裂（DSB）将迅速导致组蛋白变体H2A.X的磷酸化。由于H2A.X在Ser139处的磷酸化与每个DSB均具有良好的相关性，因此，磷酸化H2A.X是用于检测DNA损伤和晚期细胞凋亡的灵敏标记物。
结论
程序性细胞死亡（细胞凋亡）受到与线粒体去极化、半胱天冬酶相关凋亡酶级联反应、DNA片段化以及最终细胞空泡化和损伤相关的多种信号传导和效应途径控制。在许多疾病（如癌症）中，这些事件与其他相关事件共同产生基因损伤，从而使凋亡的检测和测量在许多研究测定中极为有用。我们已发布的凋亡检测试剂盒，包括ApopTag® TUNEL检测系列和CaspaTag™原位Caspase检测系列，有助于通过可重复性分析深入了解细胞死亡的机制。
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