采用单克隆抗体亲和凝胶进行的FLAG融合蛋白免疫沉淀

• 什么是FLAG肽标签？如何将其用于蛋白质分离和纯化？
• 免疫沉淀技术概述
• 采用M2亲和凝胶进行的FLAG融合蛋白免疫沉淀（IP）实验方案
• 少量FLAG融合蛋白纯化

免疫沉淀（IP）可用于高效、高产量分离和纯化与FLAG^®肽标签融合的蛋白质。此过程采用ANTI-FLAG^® M2亲和凝胶进行，后者是一种与琼脂糖树脂共价结合的高度特异性单克隆抗体。亲和树脂可有效结合FLAG^®标记蛋白，无需进行预先处理步骤和校准。免疫沉淀的FLAG^®标记融合蛋白可以在酸性条件下或通过与FLAG^®肽竞争，从树脂上有效地洗脱下来。随后可以分析免疫沉淀的蛋白质的大小、翻译后修饰以及电泳过程中的凝胶相互作用，同时可进行活性分析。

采用M2亲和凝胶进行的FLAG融合蛋白免疫沉淀（IP）实验方案，其中的M2亲和凝胶含有与交联的4％琼脂糖珠共价结合的M2单克隆抗体

使用EZ view红色 Anti-FLAG M2 亲和凝胶(货号：F2426)或Anti-FLAG M2亲和凝胶(货号：A2220)。

少量FLAG融合蛋白纯化

注意：推荐针对免疫沉淀步骤采用两种对照反应

• 阳性对照（FLAG-BAP融合蛋白，如氨基末端(货号：P7582)、羧基末端(货号：P7457)或Met-FLAG-BAP融合蛋白(货号：P5975）
• 阴性对照（无蛋白的空白试剂）

a) 小心混合亲和凝胶珠，直至完全悬浮。立即使用宽孔移液器吸头（或从常规移液器吸头的末端切1 mm）将40 µL 0％浆液（20 µL填充凝胶体积）等分到1.5 mL离心管中。

b) 洗涤/平衡珠子：加入500 µL TBS（50 mM Tris HCL，150 mM NaCl，pH 7.4），涡旋并5,000-8,200 x g离心30 – 60秒。除去上清液，注意不要干扰小珠。

c) 再次如上所述洗涤，然后将试管放在冰上直至临加样。注意：当同时处理多份免疫沉淀样品时，洗涤所需的树脂总量。每次洗涤应使用TBS进行，体积至少应为填充凝胶总体积的20倍。洗涤后，可等分树脂以获得所需数量的样品。

d) 样品制备：

• 通过离心（14,000 x g，2–4°C下持续10–15分钟）澄清细胞裂解液
• 计算所需的裂解液量。具体体积取决于转染细胞中FLAG融合蛋白的表达水平。

e) 结合：加入200–1000 µL细胞裂解物（如果需要，可加入裂解缓冲液[50 mM Tris HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100]至终体积1 mL）。注意：裂解物体积取决于转染细胞中FLAG融合蛋白的表达水平。对于阳性对照，加入1 mL TBS和4 µL 50 ng/µL FLAG-BAP融合蛋白（约200 ng）。对于阴性对照，仅添加1 mL裂解缓冲液。在2-8°C下，使用水平或直立摇床振荡孵育约1-2小时（结合步骤可延长过夜，以确保尽可能高的结合效率）。

f) 将离心管 5,000- 8,200 x g 离心30秒至1分钟，吸出上清液（流通液）。如果需要，可以保留流通液。

g) 洗涤磁珠：加入500 µL TBS，涡旋并5,000-8,200 x g离心30秒至1分钟。去除上清液

h) 再洗两遍。

i) 洗脱样品：可选择三种洗脱方法，具体选择取决于标记蛋白质的特性以及下游应用。

1. 在天然条件下，可通过使用3X FLAG肽（货号：F4799）竞争来洗脱FLAG融合蛋白。这种洗脱方法最有效。
2. 可在酸性条件下使用0.1 M甘氨酸HCl（pH 3.5）进行洗脱。这种洗脱方法快速有效，但需要立即中和样品。
3. 可通过使用SDS-PAGE样品缓冲液进行电泳来实现洗脱。如果使用此方法，则磁珠不能再次使用，因为SDS会使M2抗体变性。

用3X FLAG肽（F4799）洗脱

i. 3X FLAG肽制备：

• 将3X FLAG肽溶解在含 0.5 M Tris HCL、1 M NaCl 的 pH 7.5 溶液中 ，终浓度为25 µg / µL
• 用diH₂0将储备溶液稀释5倍至终浓度5 µg / µL
• 将3 µL 5 µg / µL储备液添加到100 µL TBS中，制备150 ng / µL浓度的洗脱工作溶液。

ii.向每份样品中加入100μL3X FLAG洗脱工作溶液，并在2–8°C轻轻摇动孵育30分钟。

iii.5,000-8,200 x g离心30秒至1分钟。将上清液转移到新管中。注意不要转移任何树脂。

1.在酸性条件下洗脱（0.1 M甘氨酸HCl pH -3.5）在室温下进行。

i. 向每份样品中添加100 µL 0.1 M甘氨酸HCl，pH 3.5
ii.轻轻摇动孵育5–10分钟
iii.5,000-8200 x g 离心树脂30秒至1分钟
iv.将上清液转移到装有10 µL 0.5 M Tris HCl、1.5 M NaCl，pH 7.4的新试管中，中和样品
v. 立即使用或-20°C长期保存。

2.用SDS-PAGE样品缓冲液（62.5mM Tris HCl，pH 6.8和2％SDS，10% (v/v)甘油和0.002％溴酚蓝）洗脱。在室温下进行。

注意：为最大限度避免抗体变性，不可加入还原剂（DTT或2-巯基乙醇）。加入还原剂会使固定的M2抗体重链和轻链解离（25-50kDa条带）

i. 向每份样品中添加20 µL 2X 样品缓冲液
ii.煮沸样品3 min
iii.5,000-8200 x g离心30秒至1分钟
iv.将上清液转移至新试管中。样品可直接上样至SDS-PAGE。