RIP试剂盒的哺乳动物细胞Ago抗体-RNA免疫沉淀实验方案
试剂 | |
|---|---|
| 货号 | 说明 |
| RIP | Imprint® RNA免疫沉淀试剂盒 |
| SAB4200085 | AGO2单克隆抗体，大鼠，克隆号11A9 |
| R9255 | 兔抗大鼠IgG（全分子）抗体 （又名兔抗大鼠） |
| I4131 | 大鼠血清IgG |
| 09691 | 乙酸铵溶液，5M |
| Ambion AM9520 | 线性丙烯酰胺(5 mg/mL) |
| I9516 | 2-丙醇 |
准备细胞
- 细胞培养至约80%融合度。 每次RIP约需2百万细胞，或约4百万细胞，用于Ago2和IgG（阴性对照）的2次RIP
- 用HBSS（体积 = 培养基）清洗细胞
- 如细胞贴壁，加入胰蛋白酶-EDTA溶液反应约5分钟进行解离，接着加入4-5倍体积的含血清液体灭活
- 细胞计数，按2百万细胞/管分装，并按4 oC、1000 rpm、5 min离心沉淀。弃上清。
- 用冰冷的PBS（体积 = 弃液）洗涤2次。
- 弃上清，加入200 µL温和或剧烈的裂解缓冲液 + 蛋白酶抑制剂复合物(PIC)(P8340) + 核糖核酸酶抑制剂（RNase抑制剂）(R1158)/细胞沉淀
| 试剂 | 1份RIP | 2.1份RIP |
|---|---|---|
| 裂解缓冲液 | 0.2 | 0.42 mL |
| PIC（蛋白酶抑制剂复合物） | 2.0 | 4.2 µL |
| RNase抑制剂 | 0.8 | 1.68 µL |
- 冰上孵育15分钟（或-80 oC保存）
- 按4 oC, 16,000g, 10 min离心沉淀碎片
- 将上清转移至新管
- 每份细胞裂解液取10 µL作为5% input（5%起始样）并置于冰上保存
准备磁珠
- 在1.5 mL试管中，将40 µL蛋白A磁珠加入200 µL洗涤缓冲液，用于2次RIP(IgG & Ago2)
- 将管子放在磁力架上处理，弃液
- 用200 µL洗涤缓冲液洗涤1次
- 用200 µL洗涤缓冲液重悬
- 加入5 µg兔抗兔IgG（全分子）抗体(R9255)
- 室温振荡孵育30 min。
- 稍微离心，在磁力架上弃液
- 用1 mL洗涤缓冲液洗涤2次。
- 用200 µL洗涤缓冲液重悬，并分装为2 x 100 µL
- 加入2.5 µg大鼠IgG(I4131)或大鼠抗AGO2单克隆抗体，克隆号11A9(SAB4200085)。
- 室温振荡孵育30 min。
- 稍微离心，在磁力架上弃液
- 用0.5 mL洗涤缓冲液洗涤2次。
- 在磁力架上充分除去洗涤缓冲液。
进行RIP反应
- 准备免疫沉淀缓冲液(IP Buffer)：
| 试剂 | 份数 | 2.1 x 温和 | 2.1 x 剧烈 |
|---|---|---|---|
| 洗涤缓冲液 | 1 | 0.63 mL | 1.68 mL |
| PIC（蛋白酶抑制剂复合物） | 10 | 6.3 µL | 16.8 µL |
| RNase抑制剂 | 4 | 2.52 µL | 6.72 µL |
- 用0.2 mL IP Buffer重悬磁珠沉淀
- 确认每份细胞裂解液已取5% input于冰上保存
- 温和裂解的细胞加入0.1 mL IP Buffer/cells，剧烈裂解的细胞加入0.6 mL/cells
- 将稀释后的裂解液与重悬磁珠混合
- 4 oC振荡孵育
清洗
1a.温和洗涤时，洗涤5次，每次加入1mL洗涤缓冲液，涡旋振荡后稍微离心，在磁力架上收集磁珠并弃
上清
1b.剧烈或严格洗涤时，需进行1x 1ml洗涤缓冲液，2x 1mL严格洗涤缓冲液和2x 1mL标准洗涤缓冲液
严格洗涤缓冲液 | |||
|---|---|---|---|
| 试剂 | 起始 | 最终 | 10 mL |
| 洗涤缓冲液 | 1 | 10 mL | |
| 100% Igepal | 0.05 | 1 | 0.095 mL |
| 5 M NaCl | 0.15 | 0.9 | 1.5 mL |
- 最后一次洗涤后，用0.2 mL洗涤缓冲液重悬
- 用洗涤缓冲液将保存的input样定容至0.2 mL
纯化RNA
- 每份0.2 mL RIP或input加入0.5 mL Tri Reagent (T9424)
- 每份再加入0.1 mL氯仿(C2432)，充分涡旋后进行4oC, 16,000g, 10 min离心
- 准备1.5 mL管，含
6 µL线性丙烯酰胺(Ambion; 5mg/mL)
60 µL 5M乙酸铵(09691)
600 µL 2-丙醇(I9516) - 将上述溶液转移至管中，涡旋后-80 oC沉淀至少1小时
- 冰上解冻-80 oC管
- 按4 oC, 16,000g, 10 min离心
- 小心倒掉上清
- 用0.5 mL 70%乙醇清洗1次
- 按4 oC, 16,000g, 10 min离心
- 小心倒掉上清，在层流罩中干燥沉淀
- 每份用10 µL无RNA酶的水重新水化
材料
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