提高可重现性：抗体操作规范

简介

在实验室计时器蜂鸣不止、报告和授权截止期限迫在眉睫时，很容易放松对实验室试剂质量的授权。

最近因未在实验前验证试剂引起的风险屡屡登上业内头条，其中更是不乏多年努力付诸东流、重现重要结果成为泡影、商业实体间的伙伴关系一夜崩塌的实例。

最令人感到沮丧的一个例子莫过于多伦多某研究所怀疑其研究胰腺癌生物标志物所用的抗体存在问题。在花费了两年时间、500,000美元的投入、在其它鉴定方法上浪费了数千份患者样品后，该小组发现他们本认为靶向CUZD1的抗体实际靶向CA125。¹

尽管存在许多值得借鉴的惨痛教训，许多实验室仍未验证其抗体特征。可能对于一部分人来说，早期研究验证太过费时。而另外一部分人则难以判断验证的起始时机。但由于初期研究未验证试剂和细胞系，工作成果无疑可能受到影响。此外，越来越依赖学术发现开发临床试验候选药物的制药公司指出，缺乏验证试剂的标准操作规范是导致临床前研究可重现性和后期临床试验失败率高的因素之一。

尽管试剂质量的责任在于供应商，但研究人员同样要为此承担责任——毕竟可重现研究的个人回报很高。相对于供应商承担的底线责任，公开撤稿和生产效率损失对于研究人员职业前途造成的损失要沉重的多。

通过若干小步骤，可降低研究人员进行实验时无意暴露的风险。其中部分步骤只要求在购买产品之前巧妙提问，或在开封试剂盒时记录产品信息。其他步骤则需要利用验证策略工具组合，以确保关键试剂符合特定特征、功能和结构实验要求。

抗体

鉴于哺乳动物免疫系统自身性质，抗体通常是不完美的生物产品。这种缺陷通常会影响特异性、选择性和可重现性。今天，缺乏充分鉴定的抗体以及可用的应用数据有限，成为研究圈的棘手问题。尽管的确存在部分供应商蓄意出售错误标记的抗体的情况^1,10，但许多研究人员仍开始忽视支持数据需求，从而使自身研究的质量和可重现性暴露在风险下。无论供应商是否负责，研究人员都应在进行实验前评估每一种抗体，从而为自己的实验和职业前途提供保障。这一方法既降低珍贵样品丢失的风险，同时提高了可重现性信心保障。

尽管抗体缺乏特异性和选择性可能是由于储存条件不当或生物靶标异常复杂所致，但抗体结合特性同样受到生产和纯化工艺相关的许多因素制约。

抗体通过用目标抗原攻击宿主动物产生。该宿主的血清将包含由许多不同B细胞产生的多克隆抗体，每个B细胞都会产生一种识别抗原不同表位的抗体。从宿主脾脏分离单个B细胞并使其逐一融合到永生化的骨髓瘤细胞中，从而产生单克隆抗体。单克隆抗体的单表位特异性源于抗体仅由一种B细胞产生。尽管单克隆抗体可能更具特异性，但表位结构的任何微小变化都会大幅降低结合亲和力。

特异性还取决于抗体纯化采用的方法。相对于免疫原亲和纯化，蛋白A或蛋白G纯化的产物均质性较差。此外，人们还应意识到所购的抗体可能存在批次间的差异——特别是多克隆抗体。

为确保购买的抗体特异性和稳定性俱佳，研究人员首先应谨慎选择抗体供应商。通过详细说明抗体特性及其生产工艺的规格单页和其他文档，可以预估供应商的可靠程度（参见框1：选择抗体供应商时须考虑的八大因素）。此外，查看宣传许多知名供应商无法提供的小众抗体的相对不知名供应商的产品目录时，应特别注意此类信息。

由于需要高质量抗体的应用和实验数量非常多，许多供应商提供了由第三方或外部研究人员生成的应用验证数据（数据示例见图1-4）。由于提供了相关数据及建议的滴度，这些第三方提高了抗体成功使用的概率。部分最强大的数据提供者包括人类蛋白质图谱计划(www.proteinatlas.org)、抗体资源(www.antibodyresource.com),、Biocompare (www.biocompare.com)、1degreebio (www.1degreebio.org)、以及人类蛋白质组织 (HUPO) 的人类抗体计划 (HAI)——该计划已生成针对人类蛋白质的验证抗体Antibodypedia (www.antibodypedia.org)目录。

由于无法从供应商说明书或第三方数据推断抗体特异性、选择性和可重现性，因此必须进行确认检测。即使是信誉良好的供应商也无法确保包装运输或实验室处理时不存在完整性损失。2鉴于上述原因，无论是在收货时还是在实验室定期使用间期，谨慎测试、储存并考虑每种抗体的真正效用 对于保护实验结果的完整性至关重要（见框2：抗体验证技术和框3：抗体储存要点）。

尽管可使用评估或应用数据，但没有适用于整个研究圈的通用指南。按照HUPO蛋白质组学标准计划，协会成员发布一项提案，正式确定用于验证抗体和其他蛋白质亲和试剂的标准。提议的关于蛋白质亲和试剂的最低信息(MIAPAR)³明确了供制造商、供应商、QC实验室、用户和各类数据库使用的产品信息检查清单。通过该检查清单，可更明确地比较并选择最适合特定应用的亲和试剂。

框1.选择抗体供应商时须考虑的八大因素

在购买抗体之前询问供应商一些简单的问题，有助于区分供应商是否可靠。信誉良好的供应商很乐意回答以下问题：

1. 你们能否提供有关抗体滴度、免疫原或表位序列，以及各种验证应用的文件？
2. 目前是否存在有关该抗体的参考文献和期刊引文？
3. 采用了哪些阳性和阴性细胞系对照？
4. 采用哪种抗体纯化方法？虽然纯化方法选择不一定与抗体质量相关，但单克隆和多克隆抗体采用不同的纯化方法不同。对于单克隆抗体，Protein A/G 纯化即可。对于多克隆抗体，可采用亲和纯化方法替代Protein A/G纯化。
5. 支持的抗体性能数据是否与天然或重组抗原对应？对于蛋白质免疫印迹（WB）数据，供应商应提供整个凝胶的印迹，而不单单是目标条带。最好分析多个细胞系。
6. 抗体是内部生产,还是从外部供应商购得？如果从外部供应商购得，是否愿意分享其供应商的身份或说明如何检验外部购得的抗体质量？
7. 是否提供指定应用的抗体性能数据？如果提供，能否顺便提供相关操作方案？如果不能提供，供应商是否设有保证计划，允许研究人员在一年内自行验证抗体并在出现问题时退货？
8. 针对抗体特性和纯化的具体问题，是否可提供技术支持解答？

框2.抗体评估技术

蛋白质免疫印迹（WB）分析是新抗体使用前评估的最简单的起始步骤。如果最终应用并非蛋白质免疫印迹（WB）——无论是ELISA、免疫组化、免疫沉淀还是其他技术——则必须针对该应用测试抗体。

抗体评估的频率取决于抗体的克隆能力。单克隆抗体是公认的高度特异性优质试剂，可产生最具可重现性的结果，因此可能只需要在首次使用前测试。多克隆抗体的批次间差异较大，因此需要针对每批材料进行评估。如果新批次材料性能与之前批次不同，请首先联系供应商，看看他们是否进行了任何细微的改造（例如免疫原序列），并在必要时寻求技术建议。

蛋白质免疫印迹（WB）

进行蛋白质免疫印迹分析时，须使用一组具有不同目标蛋白表达水平的阳性和阴性细胞系。如果不存在此类细胞系，则在非表达细胞中转染目标蛋白以创建阳性对照或使用 RNAi敲低目标蛋白以创建阴性对照。

评估多条带的最终印迹很重要。理想情况下，单克隆抗体和纯多克隆抗体应仅产生一条目标蛋白条带。部分情况下，除目标条带外，这些抗体还会产生多个较浅的条带。将这些条带与供应商的完整蛋白质免疫印迹（WB）图像进行比较。如果不存在多个浓度的目标条带，请咨询供应商和/或丢弃抗体。

条带图案不代表抗体一定存在缺陷，但可能表明目标蛋白以多种同种型表达，或经历同样与抗体相互作用的翻译后修饰。如果存在多条低分子量条带，也可能表明细胞裂解物降解。对于更灵敏的应用，多个条带可能表示需要换用单克隆或高度特异性的抗体。

平均时间：4 小时 平均费用：$100至$400

质谱和毛细管电泳

当特定应用（例如，生物标志物验证或治疗制剂开发）需要精密鉴定时，可通过液相色谱=质谱检测联用(LC-MS)分析单克隆抗体的结构组成。可通过亚基图谱、肽图谱、N端测序和聚糖分析等方法，可研究分子量、氨基酸序列、翻译后修饰和其他修饰、碳水化合物结构和二硫键等特征。毛细管电泳类方法还可提供纯化抗体制剂的详细纯度、分子量、等电点和电荷异质性参数。

对于普通研究人员来说，通常不需要这些技术。

平均时间：14–21天（常见服务提供商）
平均成本：$1,500至$3,500

框3.抗体储存和使用要点

如果储存时间增加及储存条件不当，抗体性能会显著下降。除供应商提供的建议外，以下做法同样有助于最大限度维持抗体性能和使用寿命。

储存

• 将抗体等分为多份（例如20 μL），以避免污染并最大限度地减少冻融循环——尤其适合长期储存。部分抗体制剂含有甘油、BSA或其他蛋白质稳定剂，可耐受反复冻融循环，但仍建议您最好避免非必要的温度变化。
• 请勿将抗体储存于“无霜”冰箱中。
• 如果长期储存后出现轻微浑浊，请在使用前通过离心澄清溶液。
• 如需连续使用，可将抗体在2-8 °C保存至多一月。
• 监控冰箱温度并保存温度日志。如果温度高于或低于所需阈值，则程序会发出警报。
• 为最大限度地提高样品复苏率，处理或储存抗体时请使用低吸附管。
• 开封新供应的抗体时，在实验室笔记本中记录开封日期、批次/批号、产品编号、有效期、等分标签和任何特殊说明。如无这些信息，后期难免存在疑虑或疏漏。

使用方法

• 为提高抗体性能可信度，Sigma-Aldrich建议对多克隆抗体进行逐批验证。单克隆抗体虽具有更高的批次间一致性，但仍应针对各批次分别验证。
• 在实验台上操作时，请将抗体置于冰上。
• 为获得完美结果，首先通过滴定测试确定适合自身应用的最佳抗体工作浓度。
• 工作稀释样品应在制备后12小时内丢弃。