Northern和Southern印迹实验方案及简介

Southern Blotting实验方法
Northern Blotting实验方案

什么是Northern和Southern印迹？

核酸与蛋白质等大分子向固相支撑膜的转移称为印迹。通过凝胶电泳分离的DNA和RNA分子的片段分别在称为Southern和Northern印迹的过程中转移到尼龙或硝酸纤维素膜上。Southern印迹由Edwin Southern于1975年推出，是一种检测DNA样品中特定DNA序列的方法。基于该方法出现的其他印迹技术被称为Northern印迹（用于RNA）、Western印迹（用于蛋白质）、Eastern印迹（用于翻译后蛋白质修饰）和Southwestern印迹（用于DNA-蛋白质相互作用）。

Southern和Northern印迹实验方案包括以下主要步骤：

• DNA/RNA的纯化：从细胞或组织来源中提取和纯化DNA/RNA。
• 消化DNA：用限制酶把DNA消化成片段。RNA不需要该步骤。
• 凝胶电泳：在琼脂糖凝胶上分离DNA片段。RNA样品可以在琼脂糖凝胶上用甲醛分离，甲醛作为限制RNA分子二级结构的变性剂。
• 转膜：将DNA/RNA片段从凝胶转移到尼龙膜上。
• 预杂交（封闭）：用含有鲑鱼精子DNA的预杂交溶液清洗尼龙膜，以封闭非特异性DNA相互作用并降低背景噪音。亦可使用PerfectHyb™ Plus缓冲液，这种情况下不需要用鲑鱼精子DNA进行封闭。
• 探针的制备：准备新的探针DNA并用³²P α标记的dCTP标记。
• 杂交：用标记的探针孵育印迹。
• 探针的检测：在-80 °C下曝光胶片，检测探针和目标DNA/RNA序列。

Southern印迹实验方案

所需材料

• 用于DNA分离和纯化的试剂
  
• 用于限制性消化DNA的试剂
  
• 琼脂糖凝胶电泳的试剂和缓冲液
  
• 琼脂糖凝胶电泳仪
  
• Whatman滤纸
  
• 纸巾
  
• 带正电荷的尼龙膜
  
• 鲑鱼精子DNA
  
• 杂交管
  
• X光胶片 
  
  

所需缓冲液

• 10X TBE（93290），用于凝胶电泳。对于较大的DNA片段，可以使用TAE缓冲液（65497）代替TBE。或者使用Bionic™缓冲液（B6185）代替TAE或TBE，以在更短的时间内获得更清晰的条带。您可以使用以下试剂制备10X TBE缓冲液：
  
  TRIS 1.3 M
  硼酸 450 mM
  EDTA 25 mM
  
  
• 20X SSPE（S2015），用作预杂交和转膜缓冲液。在类似的印迹实验方案中，可以使用20X SSC（93017）代替SSPE。或者您可以使用以下试剂制备20X SSPE溶液：
  
  NaCl 2.98 M
  EDTA 0.02 M
  磷酸盐缓冲液（pH 7.4）0.2M
  
  
• 变性溶液（N1531），用于使dsDNA变性，以使其与探针结合。或者您可以使用以下试剂制备1X变性溶液：
  
  NaCl 1.5 M
  NaOH（S5881）0.5 N
  将pH调节至~13
  
  
• 中和溶液（N6019），用于在变性dsDNA后中和凝胶。或者您可以使用以下试剂制备1X中和溶液：
  
  NaCl 1.5 M
  TRIS HCl 1M
  将pH调节至7.5
  
  
• *Denhardt溶液（D2532），在预杂交过程中用于封闭非特异性DNA杂交。或者您可以使用以下试剂制备50X Denhardt溶液：
  
  牛血清白蛋白（A7906）1％
  聚蔗糖（F2637）1% 聚乙烯吡咯烷酮（PVP40）1%
  
  将组分溶解在水中至最终体积为50 mL。过滤除菌。
• *2X预杂交溶液（P1415），用于准备探针杂交所用的膜。或者您可以使用以下试剂制备1X预杂交溶液（100 mL）：
  
  20X SSPE 30 mL
  100X Denhardt溶液10 mL 10％ SDS 10mL 水50 mL
  
  
• *杂交溶液（H7140），用于杂交步骤。或者您可以使用以下试剂制备杂交溶液（100 mL）：
  
  20X SSPE 30 mL
  10% SDS 10 mL
  水60 mL
  
  
• 1X探针缓冲液，用于探针混合物。（100μL；新鲜制备）：
  
  1 M TRIS，pH 7.6 50μL
  2 M MgCl₂ 5μL
  0.5 M DTT 10 μL
  水35 μL
  
  
• 1X探针混合物（27 μL）：
  
  探针缓冲液 2.7 μL
  寡核苷酸探针（0.2 μg/μL）2μL
  T4磷酸核苷酸激酶（PNK）1 μL
  水11.3 μL ³²P-ATP 10 µL
  
  
• 6X低苛性洗涤溶液，用于去除低同源性杂交并降低背景噪音。使用以下试剂制备600 mL洗涤溶液：
  
  20X SSPE 180 mL
  10% SDS 12 mL
  水408 mL
  
  
• 1X高苛性洗涤溶液，用于去除紧密同源杂交，并进一步降低背景噪音。使用以下试剂制备600 mL洗涤溶液：
  
  20X SSPE 30 mL
  10% SDS 12 mL
  水558 mL

*PerfectHyb™ Plus杂交缓冲液（H7033）可用来代替Denhardt、预杂交和杂交溶液。PerfectHyb™ 缓冲液经过优化，可在短至1-2小时的杂交中产生最大信号，且背景最小。PerfectHyb™ Plus配方适用于使用任何类型的探针、以及在任何类型的膜（带正电或中性尼龙和硝酸纤维素）上进行的任何杂交实验方案。 

DNA分离

Sigma-Aldrich 提供 GenElute™ 试剂盒，用于从植物和真菌 (E5038)、哺乳动物细胞或组织 (G1N70, G1N10 和 G1N350) 、以及血液(NA2010 和 NA2020)中分离 DNA。可以在这里找到使用GenElute™试剂盒进行DNA分离的详细实验方案。

此外，DNAstable^® 试剂盒 (93000-001-1EA, 93021-001-1EA, 53091-016-2ML 和 93121-017-1EA)可用于DNA运输或确保DNA在室温下的储存和稳定。

限制性酶切

用适当的限制性酶在37 °C消化DNA 2-24 h。如果DNA样品是克隆衍生产物，则1-2小时的消化时间就足够了。对于基因组DNA，通常需要用过量的酶（5-10X）孵育过夜。

如有必要，使用乙醇沉淀法浓缩消化的DNA。在凝胶上分离之前，必须完全除去痕量乙醇。

凝胶电泳

在琼脂糖凝胶上溶解消化的DNA。TAE应该用于较短时间的运行（<4小时）和较大的DNA片段，而TBE应该用于较长时间的运行（> 4小时）和较小的DNA片段（<1kb）。或者使用Bionic™缓冲液（B6185）在比TAE或TBE更短的时间内获得更清晰的条带分辨率（有关更多信息，请参见Bionic™缓冲液数据）。用溴化乙锭染色凝胶，并使用UV透照仪获得凝胶图像。如果在电泳之前将溴化乙锭掺入琼脂糖中，则可以在运行后立即获得凝胶图像。

转膜

在转膜步骤中，来自电泳凝胶的DNA（或RNA）将被转移到尼龙膜上，以使探针易于杂交和检测。

• 将凝胶转移到含有变性溶液的托盘中，溶液要足以完全覆盖凝胶。用这种溶液洗涤凝胶两次，每次洗涤在摇床上持续25分钟。
  
• 用水冲洗凝胶两次。
  
• 用中和溶液洗涤凝胶两次，每次洗涤在摇床上持续15分钟。
  
• 用水冲洗凝胶两次。
  
• 用20X SSPE在摇床上洗涤凝胶30分钟。
  
• 在上述步骤中，准备用于转膜步骤的Whatman纸和膜。
  
• 切下一条尼龙膜（15356），将其浸泡在水中。切下一条比凝胶宽的Whatman纸，将其浸泡在10X SSPE缓冲液（转膜缓冲液）中。
  
• 切下三条几乎与凝胶大小相同的Whatman纸。
  
• 切下数张几乎与凝胶大小相同的纸巾。
  
• 在含有10X SSPE的托盘上放置一个稳定的平台。
  
• 在平台上放一张saran保鲜膜。在saran保鲜膜上，放一张浸有10X SSPE的Whatman纸。用玻璃棒在它们上面滚动，以把气泡撵出。确保Whatman纸的边缘接触托盘中的SSPE缓冲液。这张Whatman纸将充当芯子，将SSPE缓冲液向上吸并穿过凝胶，以在尼龙膜上沉淀DNA条带。
  
• 将凝胶面朝下放在湿润的Whatman纸上。将膜放在凝胶上面。用玻璃棒在它们上面滚动，以把气泡撵出。
  
• 在膜上放置三层Whatman纸。用玻璃棒在它们上面滚动，以把气泡撵出。
  
• 在这上面放一叠纸巾，然后放上重物（如玻璃板）。
  
• 让这个组装静置过夜，以完全转移DNA片段。将不超过15kb的DNA片段转移大约需时18小时。
  
• 转移完成后，将印迹放入自动设置的UV交联机中。进行UV交联以使DNA或RNA与尼龙膜共价键合，这在检测期间增强杂交信号。另一个选择是在转膜后烘干膜，这使核酸与膜之间形成非共价的半永久键合。DNA不能与硝酸纤维素膜进行UV交联，只能烘烤。

预杂交（封闭）

预杂交（也称为封闭）步骤的作用是最大限度地减少探针对尼龙膜的非特异性附着。鲑鱼精子DNA通常用作封闭剂，用来防止探针粘附到膜上，确保它只与已经转移到膜上的目标DNA条带相互作用。按如下步骤制备预杂交溶液或使用PerfectHyb™ Plus缓冲液（H7033）：

• 将预杂交溶液加热至42 °C。
  
• 将鲑鱼精子DNA样本（D9156）加热至95 °C 5分钟，然后立即在冰上冷却。
  
• 将鲑鱼精子DNA添加到温热的预杂交溶液中，使DNA的最终浓度为50 μg/mL。
  
• 从UV交联机中取出印迹，并小心地将其卷入杂交管中。
  
• 将含有精子DNA的预杂交溶液加入杂交管中，并将其置于42 °C的杂交炉中5小时。

杂交

DNA的互补链（探针）用于检测应存在于膜上的目标序列。来自两种不同来源的DNA组合形成“杂合”dsDNA，但前提是这两条链是同源的。

• 制备1X探针混合物，在37 °C水浴中孵育40分钟。
  
• 让探针混合物通过G-25 Sephadex柱，以去除游离标记（未掺入的探针）。
  
• 用液体闪烁法确定探针的特异活性。
  
• 将10 mL杂交溶液加热至49 °C，向其中加入10-15 X⁶ cpm的探针，并充分混合。
  
• 将印迹中的预杂交溶液丢弃；在标记的探针中添加杂交溶液。49 °C孵育过夜。
  注意：或者使用PerfectHyb™ Plus缓冲液（H7033）以更短的时间杂交，产生的信号更强。如想了解更多实验方案和数据，请参见PerfectHyb™ Plus实验方案。
  
• 将6X洗涤溶液温热至49 °C。将印迹中的杂交溶液丢弃，添加6X洗涤溶液。
  
• 将6X低苛性洗涤溶液加热至49oC。将印迹中的杂交溶液丢弃，添加6X洗涤溶液。低苛性洗涤去除低同源性杂交，以留下高同源性杂交，从而精炼目标DNA样品。
  
• 制备1X高苛性洗涤溶液，并将其加热至49oC。将印迹洗涤约30秒并丢弃洗涤溶液。该步骤使用高苛性溶液去除紧密同源的杂交，以进一步精炼目标DNA。
  
• 使用盖革计数器检查印迹的活性。如果每秒有10-50条具有照射峰值的条带，就是理想的结果。如果背景太高，则用1X洗涤溶液再次清洗印迹。

检测探针

• 将印迹放入衬有新的saran保鲜膜的暗盒中，小心地将印迹包好，确保印迹和保鲜膜之间没有气泡。
  
• 将暗盒放入暗室，将X光胶片放在印迹上。锁上暗盒，将其置于-80 °C过夜。在第二天显影。
  
• 可将另一张X光片放在印迹上，并放回-80 °C进行另一次曝光。

Northern印迹实验方案

Northern印迹实验方案类似于Southern印迹实验方案，只是RNA序列是在掺入甲醛的变性琼脂糖凝胶上分离。

RNA分离

• 哺乳动物细胞或组织(RTN70, RTN10 和 RTN350)可使用TRI Reagent^® (T9424)或 GenElute™ 试剂盒从细胞或组织样品中分离 RNA
  
• 为了确定 RNA 的质量和浓度，分别在 260 nm 和 280 nm 处读取样品的吸光度。吸光度比值A₂₆₀/A₂₈₀为 1.8-2.1 表示 RNA的质量较好。

凝胶电泳

• 使用移液器将样品小心地加入孔中。如果需要，也可加入含有各种大小 RNA 片段(R7020, R7644)的适当标记物。
  
• 关于在琼脂糖凝胶电泳中使RNA变性的详细实验方案，请参见核酸电泳简介。
  

如果在电泳之前将溴化乙锭掺入琼脂糖中，则可以在运行后立即获得凝胶图像。

转膜

转膜设置、预杂交、杂交和检测的实验方案与Southern blotting相同。