羧肽酶A酶活检测

1.目标

标准化羧肽酶A的酶促测定步骤。

2.适用范围

此操作步骤适用于所有包含羧肽酶A的产品，包括但不限于牛胰腺来源羧肽酶A（货号C9268）。

3.定义

3.1 纯水=来自去离子系统的水，25 ºC条件下电阻率>或= 18MΩ•cm

3.2. 羧肽酶A单位定义 – 在pH 7.5、温度25 °C条件下，一个单位每分钟可水解1.0 μmole马尿酸-L-苯丙氨酸。

4.讨论

马尿酸-L-苯丙氨酸 ^羧肽酶A>马尿酸+苯丙氨酸

5.责任

分析服务实验室人员应遵循本书面操作流程。

6.安全

有关危险和适当的操作注意事项，请参阅安全数据说明书(SDS)。

7.操作流程

7.1 条件：
T = 25°C，pH = 7.5，A_254nm，光程= 1 cm

7.2 方法：
连续光谱法速率测定

7.3 试剂：

7.3.1    25 mM Tris HCl 缓冲液，含500 mM 氯化钠，pH 7.5，25 °C（缓冲液）
            采用纯水，制备含3.03 mg/mL Trizma碱（如货号T1503）、29.2 mg/mL氯化钠（如货号S9888）的溶液。采用1 N盐酸在25 °C下降pH调整至7.50。在室温下保存溶液。

7.3.2    1.0 mM马尿酸-L-苯丙氨酸溶液(Hippuryl-L-Phe)
             采用200 Proof乙醇制备含32.6 mg/mL马尿酸-L-苯丙氨酸（如货号H6875）的溶液。样品一旦完全溶解到乙醇中时，采用试剂7.3.1（缓冲液）进一步稀释到0.326 mg/mL。请勿调节此溶液的pH。在室温下储存溶液，并在制备后三小时内使用。

7.3.3    1.0 M 氯化钠溶液（酶稀释液）
            采用纯水制备含58.4 mg/mL氯化钠（如货号 S9888）的溶液。在室温下保存溶液。

羧肽酶A溶液（酶）

7.3.4.1 使用前，在室温下现配含有4-8 units/mL羧肽酶A的试剂7.3.3（酶稀释液）。

7.3.4.2 请勿采用低温试剂7.3.3稀释酶。

7.3.4.3 每一等份样品均需采用试剂7.3.3（酶稀释液）配制新鲜稀释液。

7.3.4.4 针对每份样品单独稀释，并再次确认来自同一容器或批次的等份样品一致。

7.3.4.5 倾倒样品前，务必振荡样品，确认所有沉到管底的材料均为均质溶液。

7.4 操作步骤

7.4.1 一次运行一等份，因为最大速率通常出现在第一分钟。

7.4.2 针对试剂7.3.2提供光谱分析空白样。由于试剂 7.3.2具有高吸光度，检测需要在精确度高于吸光度2.0的情况下运行。

7.4.3 将以下成分加入到适宜的石英培养皿中：

7.4.4 使用适宜的恒温光谱分析仪调整至25 °C，然后加入以下成分(ml)：

7.4.5 倒置混匀，然后记录大约5分钟内的在254nm出的吸光度。获取一分钟时间间隔内试样和空白反应物的最快线性速率(ΔA_254nm/min)。为保证数据有效，每次反应的ΔA_254nm/min必须处于0.05至0.1之间。

7.5 计算

    3.00 = 测定的总体积（ml）
    df = 稀释系数
    0.36 = 马尿酸在254 nm处的毫摩消光系数
    0.10 = 所用的酶体积(ml)

7.6 最终测定体系浓度：
在3.00 mL反应混合物中，终浓度为24 mM Tris、0.96% 乙醇、0.97 mM马尿酸-L-苯丙氨酸、512 mM氯化钠和0.4-0.8单位羧肽酶A。

8.参考文献

8.1 Bergmeyer, H.U., Gawehn, K., and Grassl, M. (1974) Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.U., ed.) Volume 1, 2^nd ed., 436-437, Academic Press, Inc. New York, NY