完整全转录组扩增试剂盒实验方案(WTA2)

产品描述
组分
储存/稳定性
过程
故障排除指南
常见问题
材料
参考文献
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产品描述

WTA2（一种全转录组扩增（WTA）方法）能够在区区4小时内，代表性地扩增出纳克级的总RNA而没有3'偏差。从组织、培养细胞、福尔马林固定样品或血清中所获得的微克级产物适用于例如qPCR和微阵列分析等下游应用。完整WTA试剂盒提供扩增所需的所有试剂，也包括扩增酶。

WTA实验过程包括两个步骤。在第一步中，用由半简并3'末端和通用5'末端组成的引物逆转录样品RNA。随着聚合反应的进行，置换的单链可用作引物退火和延伸的新模板。 然后用通用引物通过PCR扩增得到的cDNA文库（其由侧翼为通用末端序列的随机重叠片段组成），以获得WTA产物。当扩增完整RNA时，产物大小范围为100-1000个碱基，对于降解的RNA来说，其大小通常会更小。

成分

储存方法/稳定性

所有组分应储存在-20°C条件下。解冻使用时，所有组分应保存在冰上。如果储存温度高于-20°C 或在4°C以上放置较长时间，则WTA文库合成酶的稳定性会受到影响。RNA样品（不包括在试剂盒内）应放置于冰上进行解冻。

操作流程

按照此实验步骤进行操作，研究人员可以从5-25 ng高质量总RNA中生产得到25-40 µg WTA扩增产物。通常，当从FFPE组织中进行分离时，推荐加入5至10倍的RNA量。反应可以按比例放大或缩小以适应所需数量的最终产品的制备。

文库合成反应

1.1.解冻文库合成缓冲液、文库合成溶液。文库合成酶以及无核酸酶水。将文库合成缓冲液和文库合成溶液充分混合。通过在37℃条件下短暂加热并充分混合，以溶解溶液中的任何可能沉淀物。

2.于至少25 ng总RNA（每75μL反应5 ng，步骤10）中添加：
    a. 2.5 μL文库合成溶液
    b. 无核酸酶水至总体积为16.6 μL

注意：建议在每375μL反应（50 ng/75μL反应，步骤10）中，至少加入250 ng降解的总RNA（例如来自FFPE组织中的RNA）。

3.混匀，并在热循环仪中70 ℃孵育5分钟，然后在18 ℃下孵育。

4.向已冷却结合的RNA中立即（单独或预混后）加入以下组分
    a. 2.5 µL文库合成缓冲液
    b. 3.9 µL水
    c. 2 µL文库合成酶

5.使用以下参数在热循环仪中进行孵育：
    18ºC，10分钟
    25º C，10分钟
    37º C，30分钟
    42º C，10分钟
    70º C，20分钟
    4º C

6.通过离心和混合来合并冷凝的部分。

扩增反应

7.解冻扩增混合液和10 mM dNTP混合液。

8.准备以下预混液
    a. 301 μL无核酸酶水
    b. 37.5 μL扩增混合液
    c. 7.5 μL WTA dNTP混合液
    d. 3.75 μL扩增酶

注：对于实时PCR，应从水体积中扣除参比染料的体积和3.75 μL的SYBR^® Green染色剂1：1000稀释液（于无核酸酶水中稀释）。应在分别加入之前立即将SYBR® Green稀释液添加至主混合液中。请为每个实验准备新配置的稀释液，

9.将步骤6（25μL）的整个文库合成反应添加至步骤8的主混合溶液中，并混合。

10.将上述（步骤9）反应液分为五个75μL反应（对于最后一个等分试样，反应体积<75μL并没有关系）。使用以下参数在热循环仪中进行孵育：
    94 ºC，2分钟。
    94 ºC，30秒，70 ºC ，5分钟（17个循环）

注：最佳扩增循环数随模板数量和质量而变化。对于5 ng高质量RNA或50 ng FFPE RNA，建议使用17个循环。由于降解水平的变化（例如，从FFPE组织分离的RNA），一些RNA样品可能需要更高的输入量和/或更多的循环。在实时定量PCR中，可通过设置超出扩增“平台”区域2-3个循环来实现最佳循环数。

11.循环完成后，将反应保持在4°C或储存在-20°C，直到准备好进行下一步的分析或纯化。WTA DNA的稳定性与在相同条件下储存的基因组DNA一样。

12.为了去除残留的引物和核苷酸，可使用任何标准PCR纯化试剂盒或等效方法对双链和单链DNA进行纯化。

13.纯化的DNA可通过测量吸光度进行定量。1个A₂₆₀单位相当于50 ng /μL DNA。由于扩增后可能存在单链DNA，因此若使用PicoGreen^®染料的测定技术通常会低估实际的WTA DNA产量。

PicoGreen和SYBR均为Molecular Probes公司的注册商标Inc.

故障排除指南

常见问题

可以使用哪种类型的RNA？
可以使用标准方法或试剂盒对RNA进行分离; 可以使用来自多种来源材料的RNA，包括血液、组织活检、培养的细胞和固定或冷冻组织。也可以使用非人源RNA，例如动物、植物或微生物。

成功进行WTA扩增需要多少RNA？
为了获得最强大的性能，应有浓度>5 ng/μL（溶于TE缓冲液中）至少50 ng的RNA，浓度<5 ng的RNA样本是不可用的。RNA可以是单链或双链的，并且应具有至少300个碱基。

如何优化扩增产量？
最佳PCR循环数可能随模板数量和质量而变化。对于5 ng高质量RNA的等分试样，推荐17个循环。如果使用实时系统，则将最佳循环数定义为2-3个循环的“平台期”的最后一个循环，在此阶段相对荧光单位保持恒定。

一旦文库扩增完成，样品应该如何纯化？
完成文库扩增后，应纯化cDNA以除去可能干扰下游应用的残留引物和核苷酸。我们推荐使用Sigma-Aldrich® GenElutePCR DNA纯化试剂盒 (NA1020) 从其他反应成分（如过量引物、核苷酸或聚合酶）中纯化出单链和/或双链扩增产物。

WTA2可用于扩增档案固定组织或降解样本吗？
可以，WTA试剂盒可有效扩增降解的RNA，包括福尔马林固定和石蜡包埋的样品。然而，为了可接受地扩增最终产品，降解的样品需要使用更多的起始材料，但应不超过300 ng。

WGA2试剂盒提供哪些材料？
WGA2为第一链合成、第二链合成和cDNA文库扩增提供了所有必需的缓冲液、引物和酶。

我需要量化我的WTA产物，首选方法是什么？
应使用UV吸光度（A₂₆₀）以1 OD =50 μg/mL的转化率来定量纯化的产物。PicoGreen^®不能用于定量，因为它不能有效检测单链产物，从而会低估DNA产量。从高质量人类总RNA产生的每个等分试样文库将产生4至8μg的WTA产物。如果进行电泳，产物在0.8％琼脂糖凝胶上显示为尺寸分布为0.2 kb至2 kb的拖尾。产物的产量和大小分布会随样品RNA的完整性和纯度而变化。

WTA产品的下游应用是什么？
WTA扩增可以产生RNA模板的cDNA文库。可以进行诸如qPCR、传统克隆（TOPOTACloning®）、微阵列等的应用。

WTA2系统是否具有3'引物偏倚？
没有，该系统使用通用末端的准随机WTA引物进行cDNA产物的合成。这使得其能够扩增高度降解的RNA，其中许多可扩增的序列已经与poly-A序列分离。对于降解的和完整RNA（与3'偏倚方法进行比较）的qPCR和微阵列测试已经成功。

我可以在我的靶序列中设计我的qPCR引物吗？
WTA2系统的扩增反应是随机引发的，因此可以在mRNA内的任何位置进行引物设计。为了避免可能的基因组DNA污染造成的qPCR干扰，我们建议用DNA酶处理您的RNA并设计跨越内含子的扩增子。由于起始FFPE RNA可能会高度降解，因此我们强烈建议您在整个转录本中设计多个扩增位点。

我可以调整实验方案吗？
可以，该实验方案是被优化以产生用于微阵列分析的微克级cDNA。缩小反应体积不会影响结果的质量，只会影响最终产物的数量。

我想克隆cDNA文库 - 有什么建议吗？
cDNA产物与其他任何PCR产物相似。建议使用TOPO TA克隆法。确保设置合适的稀释度以获得最佳克隆结果。