逆转录
逆转录(RT)是指使用逆转录酶和dNTP将RNA转化为cDNA的过程。
该过程既可对总RNA进行RT步骤,从而产生代表样品中所有RNA转录本的整体cDNA(通常通过两步法),也可通过基因特异性方法,仅将目标RNA转化为cDNA(通常遵循一步法)。
下述实验可用作RT基础实验方案,供研究人员对其进行修改以满足特定要求。通常使用两步法制备cDNA,随后在加入PCR / qPCR体系之前对cDNA进行稀释,或者通过一步法反应进行制备,依次进行两个过程。
设备
- 标准 PCR 仪或加热块
- 用于 RT 设置的层流罩(选配)
试剂
- RNA(原液约 1 μg/μL)。
- ReadyScript® 两步cDNA 合成试剂盒 (RDRT)。可选逆转录试剂盒也可与 oligo-dT 引物和/或随机引物联合使用。
- PCR级水:PCR级水(W1754或W4502),20mL等分试样;冻存;每次反应均使用新鲜的等分试样。
耗材
- 无菌过滤器移液管吸头
- 无菌 1.5 mL 螺旋盖微量离心管 (CLS430909)
- PCR管和PCR板,选择一种以匹配所需格式:
• 独立的薄壁200 μL PCR管(Z374873或P3114)
• 板
- 96孔板(Z374903)
- 384孔板(Z374911)
• 封板膜或盖
- ThermalSeal RTS™封膜(Z734438)
- ThermalSeal RT2RR™膜(Z722553)
方法
准备
- 将 ReadyScript®试剂盒组件和RNA样品置于冰上。
- 混合然后短暂离心以收集管底部的内容物。
反应
- 确定所需的反应(包括控制)数量。根据表P10-26计算所有反应所需各组分的体积(移液误差允许额外增加 10%),并使用0.2 mL管或 96 孔板置于冰上合并试剂。如果使用 PCR 板,请按照板示意图进行操作,以确保将试剂添加到正确的孔中。
- 对各反应密封后,轻轻涡旋混合内容物。短暂离心,收集反应管底部的组分。
- 根据表P10-27培育反应混合物。
- cDNA 合成完成后,用 1:5~1:10 的第一链反应 (2—4 μL) 进行 PCR 扩增。
注意: 使用 ReadyScript®试剂时,可在PCR中加入2–4µL未稀释的cDNA,而不会引起抑制。如果需要,cDNA 产物可用 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)和0.1 mM EDTA 稀释,在 -20°C 保存。
材料
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