REDTaq™应用

简介
试剂
结果和讨论
结论
材料
参考文献

简介

自推出以来，REDTaq一直深受科学界欢迎。其最初的产品理念是将上样缓冲液和染料也包含在反应体系内，从而提高PCR的便利性。最终产品将允许研究人员查看哪些样品含有酶并去除PCR后产物分析中的一个步骤，但不会妨碍任何扩增DNA可能的PCR后处理。产品名称REDTaq旨在向客户强调其简单易用。这种酶会以其他方式起到类似于Taq聚合酶的作用，但可以显色。

试剂

结果和讨论

REDTaq用于下游应用

从无数可能实现上述目标的发色团中选择一种效果媲美我们的标准Taq DNA聚合酶的扩增系统。筛选过程考虑到了PCR和PCR后处理问题，例如PCR毒性、PCR产物纯化方法、限制酶切消化、连接和转化。最严格的筛选测试之一是PCR产量。从图1可以看出，新配制产品的PCR产量与Taq相当。另外，REDTaq反应混合物的PCR产物还可用于自动测序，不会引起荧光伪影，也不会阻碍测序反应或读取长度。REDTaq的一个意外好处是，实验人员可以很容易地看出反应是否充分混合了。总而言之，REDTaq的性能与我们最初设想的相同。除了可视化和直接上样的额外便利之外，添加剂对反应没有任何影响。

REDTaq在长PCR和热启动PCR中的兼容性

自REDTaq初始制剂问世以来，我们发现该制剂在以PCR混合物形式储存时完全呈惰性。 因而最近推出了REDTaq ReadyMixes。只要对初始制剂略微加以优化，即可与Taq混合物（AccuTaq™）和Taq定向抗体（JumpStart™）相容。在图2中，当模板量较少时，通过比较含有和不含抗体的REDTaq的效果，揭示了REDTaq与热启动抗体的相容性。

图 1.使用REDTaq和Taq DNA聚合酶得到的相对PCR产物产量是靶序列长度的函数。产物产量可以含有[32P] dCTP的PCR的酸不溶性计数进行定量。将产量归一化为Taq DNA聚合酶的产量。使用λ噬菌体DNA作为模板进行反应，平行两份。产物质量通过平行非放射性PCR的琼脂糖凝胶电泳进行独立检查。

图 2.含和不含热启动抗体的REDTaq。用小麦总基因组DNA进行的PCR反应： 400 bp靶扩增子。配制反应并在扩增前让其在室温孵育两小时。泳道1含有标志物。泳道2-3显示使用0.4 ng总模板和REDTaq DNA聚合酶的重复PCR。泳道4-5显示使用JumpStart REDTaq DNA聚合酶的平行两份的相同反应的产量。

优化的REDTaq PCR

由于REDTaq与Taq的性能基本相同，因此REDTaq和Taq PCR优化在操作上也是相同的。但是，REDTaq对镁的要求不同于Taq。虽然优化REDTaq和Taq的镁浓度的方法相同，但实验人员应该意识到，即使所有其他参数（模板、引物循环条件等）相同，针对Taq优化的镁浓度对于REDTaq而言也可能不理想。PCR优化通常可以通过改变以下中的一个或多个参数（按重要性顺序）来实现：模板质量、引物设计、循环参数和镁浓度。有许多优秀的综述涉及PCR优化，^1,2大多数优秀的技术图书馆包括最新的书籍，涵盖了通用的PCR技术。^3,4 通过改变前面描述的一个或多个参数，可以完成大多数复杂的PCR工作。然而，这远非PCR优化的通用方法。如果模板质量足够好，那么问题通常在于PCR退火的复杂性，其是熔化温度(T_m)的函数。T_m是引物：模板复合物的退火速率和解离速率相等时的温度。

解离是单分子反应，与浓度无关，而退火是双分子反应，取决于PCR产物和引物浓度。简而言之，在PCR期间，T_m值会发生变化。“降落”PCR技术允许T_m 计算存在一定误差。⁵ 在该方法中，退火温度需比T_m计算值高5至10度。后续循环的退火温度在循环过程中缓慢下降。降落PCR要求预扩增步骤在尽可能最严格的退火条件下进行，后续较不严格的扩增依赖于正确扩增子的质量作用，从而超过任何副产物。这种策略很有用，因为它是一种普遍使用的扩增手段。在阳性对照实验证明PCR试剂没有问题后，值得尝试。

图 3.大片段人基因组DNA和λ DNA的扩增。泳道1-3：人基因组DNA 5、10和20 kb片段的JumpStart REDAccuTaq La扩增；泳道4：20kb λ DNA的扩增。泳道5-8与1-4相同，但使用的是竞争对手的长而准确的酶混合物。泳道9为10、8、6、5、4、3、2.5、2、1.5和1.0 kb（1 kb阶梯）的标志物。配制反应并在使用相同循环条件前让其在室温孵育两小时。

结论

含有优化反应缓冲液的REDTaq DNA聚合酶性能相同，在绝大多数应用中可直接替代Taq DNA聚合酶。不同之处是PCR很麻烦。当使用非标准镁浓度时，两者的差异就会成为一个问题。