LentiBrite GFP-HMGB1慢病毒生物传感器

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http://www.nature.com/app_notes/nmeth/2012/121007/pdf/an8620.pdf
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生物传感器可用于检测特定蛋白的存在/不存在以及该蛋白在细胞活状态下的亚细胞位置。通常需要荧光标签作为通过荧光显微镜检查或延时视频捕获可视化细胞内目标蛋白的手段。在不破坏的情况下可视化活细胞使研究人员能够实时观察细胞状况。

慢病毒载体系统是一种流行的研究工具，用于将基因产物引入细胞。慢病毒转染比非病毒方法（例如基于化学的转染）具有优势，包括更高效率的分裂和非分裂细胞转染，转基因的长期稳定表达以及低免疫原性。

EMD Millipore正在引进LentiBrite慢病毒生物传感器，一套新的预先包装的慢病毒颗粒，编码自噬、凋亡和细胞结构的重要和基础蛋白质，用于在活细胞和体外分析中在不同细胞/疾病状态下进行可视化。

• 预先包装，荧光标记的GFP & RFP
• 与传统的基于化学和其他基于非病毒的转染方法相比，转染效率更高
• 能够转染分裂，不分裂和难以转染的细胞类型，例如原代细胞或干细胞
• 对细胞功能无破坏性

EMD Millipore’s LentiBrite GFP-HMGB1慢病毒颗粒提供明亮的荧光和精确的定位，从而能够在难以转染的细胞类型中对HMGB1易位进行活细胞分析。

HMBG1（高迁移率族蛋白1）在大多数细胞的细胞核中起作用，以稳定核小体并增强转录因子复合物与DNA的结合。 在某些活化的炎症细胞中，HMGB1被主动分泌，而坏死细胞则被动释放HMGB1。 在这两种情况下，细胞外HMGB1可以通过RAGE（晚期糖基化终产物的受体）与多种免疫细胞类型结合，以刺激趋化性和细胞因子的产生，这取决于环境，导致炎症，伤口愈合或免疫原性肿瘤细胞死亡。 经历自噬的细胞还显示出HMGB1从细胞核到细胞质的易位。 HMGB1和荧光蛋白之间的基因融合表达可实时监测HMGB1易位。
EMD Millipore’s LentiBrite GFP-HMGB1慢病毒颗粒提供明亮的荧光和精确的定位，从而能够对难以转染的细胞类型中的HMGB1易位进行活细胞分析。

荧光显微镜检查成像：
（参见数据表中的图1）
将U2OS细胞铺在小室载玻片中，并用MOI为10的慢病毒颗粒转导24小时。 更换培养基并进一步孵育48小时后，将细胞用甲醛固定并封固。 通过油浸宽视野荧光显微镜检查获得图像。 GFP-HMGB1显示在细胞核中。

免疫细胞化学比较和抑制剂分析：
（参见数据表中的图2）
与图1（参见数据表）相似，将HeLa细胞铺在小室载玻片中，并用MOI为10的慢病毒颗粒转导24小时。 24小时后，更换培养基，然后将细胞进一步孵育48小时。 用核染色剂（DAPI）对相同视野进行的免疫细胞化学染色（蓝色）显示出与蛋白GFP（绿色）相似的表达模式。

难以转染的细胞类型：
（参见数据表中的图3）
将原代细胞类型HUVEC和人间充质干细胞（HuMSC）铺板在小室载玻片中，并用慢病毒颗粒以20的MOI转导24小时。

为了获得最佳的荧光可视化，建议在转染/感染后24-48小时内分析目标表达水平，以进行最佳的活细胞分析，因为荧光强度可能会随着时间的推移而变暗，尤其是在难以转染的细胞系中。成功转染/感染后，可将感染的细胞冷冻，并在培养中解冻，以在24-48小时后保持阳性荧光表达。荧光表达的长度和强度在细胞系之间变化。难以转染的细胞系可能需要更高的MOI。

研究子类别
凋亡-附加

研究类别
细胞凋亡 & 癌症

TagGFP2-HMGB慢病毒：
一个小瓶，含有25 µL慢病毒颗粒，每毫升至少3 x 10E8感染单位（IFU）。
有关批次特定滴度的信息，请参见数据表产品质量标准中的批次特定“病毒滴度”。


启动子
EF-1（延伸因子-1）


感染的倍数（MOI）
MOI=感染性慢病毒颗粒（IFU）数量与被感染细胞数量的比率。
高转导效率和信号强度的典型MOI值在20-40的范围内。 对于该靶标，某些细胞类型可能需要较低的MOI（例如，HT-1080，HeLa，U2OS），而其他细胞类型可能需要较高的MOI（例如，人脐静脉内皮细胞（HUVEC），人间充质干细胞（HuMSC））。
注：最终用户应针对每种细胞类型和慢病毒靶标对MOI进行滴定和优化，以达到所需的转导效率和信号强度。

通过HT-1080细胞的转导进行评估，并进行荧光成像以评估靶标的定位和转导效率。

PEG沉淀

储存和处理
慢病毒在-80°C下储存时，自接收之日起至少可稳定4个月。 首次解冻后，立即置于冰上，并以工作等分试样在-80°C下冷冻。 冷冻的等分试样可以储存至少2个月。 进一步的冷冻/解冻可能导致病毒滴度和转导效率降低。

重要安全注意事项
复制缺陷型慢病毒载体，例如本产品中提供的第三代载体，尚不清楚在人类或动物中引起任何疾病。 但是，慢病毒可以整合到宿主细胞基因组中，因此存在插入诱变的风险。 物料属于风险组2，应在BSL2控制下处理。 慢病毒载体的生物安全性的详细讨论在Pauwels, K. et al. (2009)中提供。 用于研究的最先进慢病毒载体：风险评估和生物安全建议。 Curr.Gene Ther.9: 459-474.

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