果胶酶的酶促检测

1.目标

建立果胶酶酶促测定的标准化操作流程。

2.适用范围

本操作流程适用于货号P4716、P0690、P2401和P4300的产品。

3.定义

3.1 纯水=来自去离子系统的水，25ºC条件下电阻率>或= 18MΩ•cm

3.2 单位定义= 在pH 4.0、25 ℃条件下，一单位每小时可从聚半乳糖醛酸中解离1.0微摩尔的半乳糖醛酸。

4.讨论

聚半乳糖醛酸+ H₂O ^果胶酶 > 半乳糖醛酸
多聚半乳糖醛酸 + I₂ > 氧化产物
2Na₂S₂O₃+ I₂ > 2NaI + Na₂S₄O₆
用硫代硫酸钠滴定过量的碘。

5.责任

分析服务实验室人员应遵循本书面操作流程。

6.安全

有关危险和适当的操作注意事项，请参阅材料安全数据手册(MSDS)。

7.操作流程

7.1 条件：

T = 25 °C, pH = 4.0

7.2 方法：
滴定终止反应

7.3 试剂：

7.3.1
0.5％（w/v）聚半乳糖醛酸（Sub）

7.31.1
向1.00 g至1.05 g聚半乳糖醛酸（货号P3889）中 加入200 mL纯水，搅拌配制溶液。

7.3.1.2
一边搅拌一边煮沸，保持沸腾五分钟整。立即放入带有浸入式搅拌器的25 ºC水浴中。搅拌至温度25 ℃恒定后，再搅拌溶液10分钟。

7.3.1.3
一边继续搅拌，一边加入0.05 mL试剂7.3.6(NaOH-2)的等分试样以调节溶液的pH值，加入间隔为1分钟，直至pH 4.0。在搅拌条件下加入0.05 mL等份的2N NaOH，直至pH保持在4.00至4.05至少10分钟。如果存在颗粒，则需通过Evergreen柱进行过滤，筛板直径最大为90 μM。

7.3.1.4
重新检查pH值，在25 ℃条件下，使用试剂7.3.3 (NaOH)边搅拌边调节pH至4.00-4.02。pH应保持在4.00-4.02的范围内至少30分钟。

7.3.1.5
可能需要每15分钟重新检查一次pH值，以确保在25 ºC时pH值在4.00到4.02范围内。如果不在此范围内，使用0.1N NaOH对pH进行调节。

7.3.2
100 mM 碘(I₂)
使用碘定量滴定标准品，0.1 N（货号318981）。

7.3.3
1.0 N氢氧化钠(NaOH)溶液（货号S2567）

7.3.4
1 M碳酸钠（Na₂CO₃）
利用纯水和碳酸钠（试剂级，货号S2127）配制106 mgs/mL的溶液。

7.3.5
2.0 N硫酸(H₂SO₄)
利用纯水和硫酸（ACS试剂级，货号258105）配制0.06 mL/mL的溶液。

7.3.6
10 N氢氧化钠（NaOH-2）
利用纯水和氢氧化钠（试剂级，货号S5881）配制400 mgs/mL的溶液。

7.3.7
100 mM硫代硫酸钠，标准化 (Na₂S₂O₃)
利用3L纯水、78.3 g硫代硫酸钠五水合物（货号S8503）和0.6 g碳酸钠一水合物（货号S4132）配制溶液。使用重铬酸钾（NIST）制备的重铬酸钾标准溶液进行标准化。

7.3.8
果胶酶溶液（酶）
临使用前，利用低温纯水配制约100单位/ mL的溶液。可能需要摇晃一分钟以上加速溶解，同时仍可能存在一些不溶性微粒。

7.3.9
1.0％（w/v）淀粉（淀粉）
在纯水中搅拌并煮沸5分钟整，配制10 mgs/mL的溶液。冷却至室温。使用可溶性土豆淀粉（货号S2004）。

7.4 测定方法

7.4.1
将以下试剂(mL)加入适宜的玻璃容器中，对照和/或样品组各一式三份：

7.4.2 旋转混匀，平衡至25 ℃至少3分钟。然后添加：

7.4.3 旋转混合并在25 ºC下孵育试样和空白样5分钟整。然后添加以下内容物：

7.4.4 旋转混匀，在黑暗条件下放置20.0分钟整。然后添加：

7.4.5 通过旋转混合，并室温放至于搅拌器上。用试剂7.3.7 (Na₂S₂O₃) 滴定至溶液呈淡黄色。然后添加以下内容物：

7.4.6 搅拌后，继续用试剂7.3.7 (Na₂S₂O₃)滴定至溶液无色。以毫升为单位记录用量。

7.5 计算

式中：
    df =稀释系数
1 = 1微摩尔半乳糖醛酸被1等微摩尔量的I₂氧化
100 = 每毫升滴定剂等微摩尔量的S₂O₃
0.100 = 酶促反应所用的酶体积(mL)
2 = 每等微摩尔量还原 I₂ 的等微摩尔量的氧化S₂O₃
5.0 = 每定义单位所需的检测孵育时间（min）

7.6 检测体系终浓度
在5.0 mL反应混合物中，终浓度下含0.49％（w/v）聚半乳糖醛酸和10单位的果胶酶。