6-磷酸葡萄糖脱氢酶（EC 1.1.1.49）的酶学测定

1.目标

建立葡萄糖-6-磷酸脱氢酶酶促测定的标准化操作流程。

2.适用范围

本操作流程适用于大多数酶促测定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性参数的产品。该测定不可用于测定来自肠膜明串珠菌的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。 

3.定义

3.1.纯水 – 来自去离子系统的水，在25 ºC的电阻率大于或等于18MΩ•cm

3.2.单位定义 - 在pH 7.4、25 °C并存在β-NADP的情况下，一单位每分钟可将1.0 μmole D-葡萄糖-6-磷酸氧化成6-磷酸-D-葡萄糖酸盐。

3.3.G-6-PDH - 6-磷酸葡萄糖脱氢酶

3.4. β-NAD = β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，氧化形式

3.5. β-NADPH - β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，还原形式

4.讨论

5.责任

分析服务人员应遵循本书面实验方案。

6.安全

有关危险因素及合适的操作注意事项，参阅安全数据说明书（SDS）。

7.操作流程

7.1.条件
T = 25 °C，pH = 7.4，A340 nm，光路 = 1 cm

7.2.方法
分光光度法速率测定

7.3.试剂：

7.3.1.   250 mM双甘氨肽（缓冲液）
利用纯水和双甘氨肽游离碱（货号G1002）配制33 mg/mL的溶液。在25 °C下用1 M NaOH或1 M HCl将pH调节至7.4。

7.3.2.   60 mM D-葡萄糖6-磷酸溶液（G-6-P）
利用纯水和D-葡萄糖6-磷酸单钠盐（Sigma-Aldrich货号G7879）在配制17 mg/mL的溶液。

7.3.3.   20mM β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐溶液（β-NADP）
利用纯水和β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸钠盐（货号N0505）在配制15.4 mg/mL的溶液。

7.3.4.   300 mM氯化镁溶液（MgCl₂）
利用纯水和1.0 M氯化镁溶液（货号M1028）配制0.3 mL/mL的溶液。

7.3.5.   6-磷酸葡萄糖脱氢酶溶液（酶）
临使用前，利用低温缓冲液（试剂7.3.1）配制0.3-0.6单位/mL的溶液。

7.4.操作流程

7.4.1.   将下列试剂(mL)加入适宜的容器，以制备反应混合物：

7.4.2.   混合并平衡至25 °C。用 1 M NaOH或1 M HCl调节反应混合物的pH至7.4。

7.4.3.   将下列试剂(mL)加入适宜的培养皿中：

7.4.4.   平衡至25 °C。使用合适的恒温分光光度计检监测A_340nm直至恒定。然后添加：

7.4.5.   立即倒置混匀，并记录10分钟内的A_340nm增量。在一分钟的时间段内使用至少4个数据点利用测试和空白试剂的最大线性速率获得ΔA_340nm/分钟。

7.5.计算

7.5.1

式中：
3 =反应体系总体积(mL)
df =稀释系数
6.22 =β-NADPH在340nm处的毫摩尔消光系数
0.1 =所用的酶体积(mL)

7.5.2

7.6.检测体系终浓度
在3.00 mL反应混合物中，终浓度为50 mM柠檬酸、2 mM D-葡萄糖-6-磷酸、0.67 mM β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、10 mM氯化镁和0.03-0.06单位6-磷酸脱氢酶。

8.参考文献

Noltmann, E.A., Gubler, C.J., and Kuby, S.A. (1961) Journal of Biological Chemistry 236, 1225- 1230.