胆固醇氧化酶的酶学测定

1.目标

建立胆固醇氧化酶酶促测定的标准化操作流程。

2.适用范围

本操作流程适用于所有测定胆固醇氧化酶促活性参数的产品。本测定法不适用于测定来自裂褶菌（Schizophyllum commune）（已停产的货号C7274）和短杆菌属（Brevibacterium sp.）(已停产的货号C8153）。

3.定义

• ODA - 联二茴香胺
• POD - 过氧化物酶
• 纯水 = 来自去离子系统的水，电阻率>或= 18MΩcm @ 25 °C。
• 过氧化物酶单位定义 — 一个单位将在pH 6.0、20 °C下，在20秒钟内形成1.0 Mg红陪酚。

4.讨论

胆固醇 + O₂ ^{胆固醇氧化酶} > H₂O₂ + 4-胆甾烯-3-酮
H₂O₂ + 邻联茴香胺（还原型） ^POD > 2 H₂O + 邻联茴香胺（氧化型）

5.责任

分析服务实验室人员应遵循本书面操作流程。

6.安全

有关危险和适当的操作注意事项，请参阅安全数据说明书(SDS)。

7.操作流程

7.1 条件：

T = 25°C，pH = 7.5，A_500nm，光程= 1 cm

7.2 方法：

连续光谱法速率测定

7.3 试剂：

• 7.3.1 50 mM磷酸钾缓冲液，pH 7.5，25 °C（缓冲液）
  利用纯水和磷酸钾（货号如P5379）配制6.8 Mg/mL的溶液。用 1 M KOH 在 25 °C 调节 pH 至 7.5。
• 7.3.2 1％（w/v）邻联茴香胺溶液(ODA)
  利用试剂7.3.1（缓冲液）和邻联茴香胺（如货号D9154）配制10.0 mg/ml的溶液。（新鲜制备）
• 7.3.3 0.5% (w/v) 胆固醇与10％（w/v）Trition X-100溶液（胆固醇）
  首先将500 mg胆固醇（如货号C8503）溶于10 mL Triton X-100中。  边搅拌边加热，直至溶液变得澄清。然后缓慢加入已温热至70-80 °C的90 ml纯水。继续在70-80 °C下搅拌溶液10分钟。加入水后溶液可能会变浑浊，但仍可用于测定。
• 7.3.4  过氧化物酶溶液(POD)
  临使用前，利用纯水和过氧化物酶（货号P8250）配制100 pyrogallol单位/ml的溶液。
• 7.3.5 胆固醇氧化酶溶液（酶）
  临使用前，利用低温试剂7.3.1和胆固醇氧化酶配制0.1-0.2单位/mL的溶液。

7.4 试验方法

1. 将下列试剂(mL)加入适宜的容器，以制备反应混合物：

2.涡旋彻底混合，然后在25 °C下用0.1 M HCl或KOH调节至pH7.5（如果需要的话）。加入试剂7.3.1至50 mL终体积，涡旋充分混合，并在使用前充氧约10分钟。

3.将下列试剂（毫升）移入合适的比色皿中：

4.倒置混合，并在适当恒温的分光光度计中平衡至25 °C。监测A_500nM恒定之前的状态。然后添加：

立即通过倒置混合，并记录约5分钟内A_500nm的增量。利用试样和空白样的最大线性速率获取ΔA_500nm/min结果。

7.5计算

7.6 单位定义

在pH7.5、25℃下，一单位每分钟可将1.0 μmol胆固醇转化为4-胆甾烯-3-酮。

注意：4-胆甾烯-3-酮可能会发生异构化。

7.7 最终检测浓度：

在3.0 mL反应混合物中，终浓度为46 mM磷酸钾、0.009％邻联茴香胺、0.017％（w/v）胆固醇、0.33％（v/v）Triton X-100、10单位过氧化物酶和0.01 - 0.02单位胆固醇氧化酶。