变溶菌素的酶促检测

描述

该操作步骤可用于变溶菌素产物。连续分光光度法测定（A₆₀₀，光路= 1 cm）是基于以下反应：

                                                                                                        变溶菌素
粪链球菌 细胞壁（不可溶） -------------------> 可溶产物

单位定义：以粪链球菌细胞壁混悬液为底物，在1 mL体积中，1单位变溶菌素在pH 6.0、37 °C条件下每分钟可产生0.01的ΔA₆₀₀。

所需试剂和设备

MES水合物 (货号M8250)
1.0 M氯化镁溶液 (货号M1028)
TES (货号T1375)
变溶菌素测定底物 (货号M3440)

制备说明

使用超纯水（25 °C时≥18 MΩxcm电阻率）制备试剂。

缓冲液（50 mM MES缓冲液，含1mM氯化镁，在37 °C时pH 6.0）— 将1.95克MES水合物 (货号M8250) 溶于190 mL超纯水中，然后加入0.2 mL的1.0 M氯化镁溶液 (货号M1028)。在37 °C条件下，使用1 M NaOH调整pH至6.0，然后使用超纯水将溶液总体积调整至200 mL。

酶稀释液（50 mM TES，含1 mM氯化镁，在37 °C时pH 7.0）— 将2.29克TES (货号T1375)溶于190 mL超纯水中，然后加入0.2 mL的1.0 M氯化镁溶液 (货号M1028)。在37 °C条件下，使用1 M NaOH调整pH至7.0，然后使用超纯水将溶液总体积调整至200 mL。

底物（粪链球菌细胞壁混悬液）— 使用约10 mL缓冲液制备对数期粪链球菌STF-3 (ATCC^® 12784)细胞的细胞壁混悬液，其浓度应使A₆₀₀在0.48-0.52范围内。或者，可根据产品数据表中的说明制备变溶菌素检测底物  (货号M3440) 。

酶溶液（变溶菌素）— 在使用前，使用预冷的(2–8 °C) 酶稀释剂制备含500–700单位/mL变溶菌素的溶液。

操作流程

在3.04 mL反应混合物中，终浓度为49 mM MES、1 mM MgCl₂、0.66 mM TES和6.5–9.2单位的变溶菌素。

1.用移液器将底物转移至合适的比色皿中。

2.在37 °C平衡并使用适当的恒温分光光度计监测A₆₀₀，直至恒定。 然后添加：

3.立即颠倒混匀并记录A₆₀₀的下降~10分钟。此过程持续长达1分钟，最少4个数据点，利用测试品和空白品的最大线性率获得ΔA₆₀₀/分钟。

结果

计算

1.

式中：
3.04 = 反应混合物体积(mL)
df = 稀释系数
0.01 = 每单位每分钟的吸光度降低值
0.04 = 所用酶溶液的体积(mL)

2.