1.目标
建立脱氧核糖核酸酶I酶促测定的标准化操作流程。
2.适用范围
该流程适用于可检测脱氧核糖核酸酶I活性的所有产品。
3.定义
3.1.纯水 – 来自去离子系统的水，在25 ºC的电阻率大于或等于18MΩ•cm
3.2.单位定义 — 在pH 5.0、25 ºC条件下，酶以I型或III型DNA为底物，使每毫升每分钟ΔA260增加0.001的变化定义为一个酶活单位（Kunitz单位）。
3.3.DNA - 脱氧核糖核酸
4.讨论
DNA + H2O 脱氧核糖核酸酶I > 5-寡聚脱氧核糖核酸
脱氧核糖核酸酶的检测没有绝对标准。Kunitz检测流程的结果受到所用底物批次的影响。就此，Sigma-Aldrich专门以我们的DNA(D3664)为底物标准化得到2,000 Kunitz单位/管的标准管酶(D4263)，以供脱氧核糖核酸酶研究。
5.责任
任何已受训的分析服务实验室人员均有责任遵守本文所述流程。
6.安全
有关危险因素及合适的操作注意事项，参阅安全数据说明书（SDS）。脱氧核糖核酸酶I是一种过敏剂，需要采取适当措施尽量减少暴露。
7.操作流程
7.1.条件：T = 25 ºC, pH = 5.0, A260nm, 光程 = 1cm
7.2.方法：连续光谱法速率测定
7.3.试剂：
7.3.1. 1.0 M乙酸钠缓冲液，25 ºC下pH 5.0（缓冲液）：使用三水乙酸钠(S8625)加纯水配制136 mg/mL溶液。用5 M HCl调节至pH 5.0(25 ºC)。
7.3.2. 100mM硫酸镁溶液(MgSO4)：使用七水硫酸镁(M1880)加纯水配制12 mg/mL溶液。
7.3.3. 0.033% (w/v)脱氧核糖核酸溶液(DNA)
7.3.3.1. 使用脱氧核糖核酸(D3664)和纯水配制。
7.3.3.2. 配成0.33 mg DNA/mL溶液。冰上静置至少30分钟，接着缓慢颠倒混匀至充分溶解。
7.3.3.3. 如需使用多管D3664，每管先单独配制，全部合并后再开始7.4.1的检测步骤。
7.3.4. 0.85%氯化钠(NaCl)
直接使用0.85%氯化钠溶液(S0817)。
7.3.5. DNase标准溶液（标液）
7.3.5.1. 将1管2000 Kunitz单位标准管酶的脱氧核糖核酸酶I(D4263)用1 mL冷的7.3.4试剂(NaCl)重悬。
7.3.5.2. 临用前，用冷的7.3.4试剂(NaCl)稀释至400-500 Kunitz单位/mL（未校正）。未校正的单位/mL对应0.067 – 0.083的ΔA260 nm/min。
7.3.6. 脱氧核糖核酸酶I酶液（试样）
7.3.6.1. 临用前，用冷的7.3.4试剂(NaCl)配制400 - 500 Kunitz单位/mL酶量的溶液。
7.3.6.2. 如无特别要求，应按10 mg/mL检测样品杂质。
7.4.检测步骤
7.4.1. 按下列方法测定7.3.3试剂中的DNA浓度：
7.4.1.1. 在适宜的石英比色皿中加入下列试剂(mL)（做2份平行）：
| Test皿 | |
|---|---|
| 纯水 | 2.90 |
7.4.1.2. 记录每个Test皿在260nm处的吸光度值。这是空白(Blank)。接着在每个比色皿中加入下列试剂：
| 7.3.3试剂(DNA) | 0.10 |
7.4.1.3. 记录每个Test皿在260nm处的吸光度值。这是Test。
7.4.1.4. 按下式计算DNA浓度：
| mg DNA/mL = | (A260nm Test - A260nm Blank) X 3.0 |
| 20 X 0.1 |
20 = DNA的E0.1%。一个A260nm单位相当于50微克DNA。3.0 = 测试溶液的最终体积
7.4.2. 配制反应混合液。在适合的器皿中加入下列试剂(mL)：
| 混合液 | |
|---|---|
| 试剂7.3.1（缓冲液） | 5.00 |
| 试剂7.3.2（MgSO4） | 2.50 |
| 试剂7.3.3 (DNA) | 6.00*（2.00mg DNA） |
| 纯水 | 36.5* |
*注意：反应混合液中的DNA和水含量可根据7.3.3试剂浓度适当调整。反应混合液中DNA的终浓度应为0.004%(w/v)或0.04mg/mL。
7.4.3. 涡旋振荡温和混合，视需要用0.1N HCl或NaOH调至pH 5.0(25 ºC)。
7.4.4. 将以下成分加到适宜的石英比色皿中：
| 空白皿 | 标液皿 | 试样皿 | |
|---|---|---|---|
| 混合液（试剂7.4.2） | 2.50 | 2.50 | 2.50 |
7.4.5. 在适宜的温控分光光度计中25 ºC平衡约5分钟，接着加入：
| NaCl（7.3.4试剂） | 0.50 | ----- | ----- |
| 标液（7.3.5.2试剂） | ----- | 0.50 | ----- |
| 试样（7.3.6试剂） | ----- | ----- | 0.50 |
7.4.5.1 如果检测不同浓度的酶，需要用7.3.4试剂(NaCl)将总反应体积调至3.00 mL。
7.4.5.2 最快的反应速率一般发生在反应最初的1、2分钟内。因此，建议最多同时操作1至2个反应。
7.4.6. 立即颠倒混合，记录A260的增加，持续约3-5分钟。获得ΔA260nm/min，对空白、标样和试样均取最大线性速率。
7.5. 计算
7.5.1.
| 单位/标准管酶 = | (ΔA260nm/min 标液 - ΔA260nm/min 空白) X (3) X (df) |
| (0.001) X (0.5) |
7.5.2
| 校正因子 = | 标准管酶的释放值(单位/管) |
| 实验值/标准管酶 |
7.5.3.
| 单位/mg固体 = | (ΔA260nm/min 试样- ΔA260nm/min 空白) X (3) X (df) X (CF) |
| (0.001) X (0.5) |
3 = 检测体积(mL)
0.5 = 每份测定所用酶体积
df = 稀释倍数
0.001 = ΔA260nm，酶活单位定义
CF = 校正因子
7.6. 检测体系终浓度
在3.00 mL反应混合液中，各试剂终浓度为83mM乙酸钠，4.2mM硫酸镁，0.14%氯化钠，0.003% (w/v)脱氧核糖核酸，200-250单位脱氧核糖核酸酶I。
8.参考文献和附件
8.1 Kunitz, M. (1950) Journal of General Physiology 33, 349-362
8.2 Kunitz, M. (1950) Journal of General Physiology 33, 363-377
8.3 Lindberg, U. (1964) Biochimica et Biophysica Acta 82, 237-248
9审批
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