用于大肠杆菌的Cas9 Lambda Red同源重组质粒

最近在大肠杆菌中使用 CRISPR/Cas9 介导的重组工程技术的论文宣称编辑效率接近 100%，这使得 CRISPR/Cas9 介导的重组工程技术成为迄今为止最强大的细菌基因组工程方法。此外，Cas9 介导的重组工程克服了对第二个重组步骤的依赖，避免了不稳定疤痕位点的产生，可用于多重操作，并且比以前的方案耗时更少。

在这里，我们推出一种新型双载体 CRISPR/Cas 介导的λ -Red 系统，用于改进大肠杆菌的重组工程。我们的系统可以促进由 Cas9 核酸内切酶产生的 DSB 的同源定向修复（homology-directed repair），从而通过供体 DNA 的染色体整合实现遗传变异。

该质粒应与定制 gRNA （CRISPRBACD）一起使用，该定制 gRNA 可通过我们的定制 gRNA 设计工具进行设计和订购。供体可以是 ssDNA 或 dsDNA，其同源臂分别为 45-59 或 150-500 个核苷酸。供体设计方案参见技术通告。

用于大肠杆菌的 Cas9 Lambda Red 同源重组质粒 （CAS9BAC1P） 包含从其天然启动子表达的来自酿脓链球菌 (spCas9) 的 Cas9 基因，以及在阿拉伯糖诱导型 ParaB 启动子的控制下的λ-red 重组酶 exo、beta 和 gam。该质粒具有卡那霉素抗性并具有 repA101ts 温度敏感型复制起点，便于质粒维护和消除。

细菌基因组编辑

• 用于突变或 SNP 分析的 HR 介导的重组工程
• 通过整合到内源基因中的启动子、融合标签或报告基因创造HR介导的基因敲入细胞系
• 在大肠杆菌细胞系中创建基因敲除

代谢工程
菌株优化

高效：将 HR 介导的整合效率提高到将近100%
无标记：不需要抗生素抗性标记插入
无疤痕：标记切除没有疤痕序列，其通常会导致脱靶重组
多重操作：一次可以使用多个自定义 gRNA 序列

CRISPR/Cas被细菌和古细菌用作防御入侵病毒和质粒的防御系统。最近，来源于 化脓性链球菌 的II型CRISPR/Cas系统已被设计为在系统中发挥作用，其使用两种分子组分：单一Cas9蛋白和非编码向导RNA（gRNA）。可以通过单个或双gRNA对Cas9内切核酸酶进行编程，从而将DNA双链断裂（DSB）导向所需的基因组位置。基于核酸酶的方法在用作微生物基因编辑工具时具有很大的毒性，因为许多细菌缺乏真核系统中存在的必需的 DNA 修复机制。然而，当用CRISPR/Cas9 介导重组工程时，这种细胞毒性性质带来了一个优势，即 Cas9 诱导的双链断裂会杀死不与供体 DNA 重组的细胞。这为无痕基因编辑（markerless, scarless gene editing）提供了一种固有的选择方法，与传统方法相比，该方法显著提高了效率并且更易于进行多重检测。大肠杆菌 HR Cas9 质粒（货号 CAS9BAC1P)包含从其天然启动子表达的来自化脓链球菌(spCas9)的 Cas9 基因，以及在阿拉伯糖诱导型 ParaB 启动子的控制下的λred 重组酶 exo、beta 和 gam 基因。该质粒具有氨苄青霉素抗性并具有 repA101ts 温度敏感型复制起点，便于质粒维护和消除。