TMB/E单一试剂，蓝色，辣根过氧化物酶底物（可溶性）

TMB（3，3′，5，5′-四甲基联苯胺）已被证明是HRP测定的安全敏感底物。最初，在HRP和过氧化氢存在下，形成单电子氧化产物。该化合物是阳离子自由基，呈蓝色，吸附最大值为653 nm。与HRP/H2O2进一步反应或用酸酸化自由基会产生二亚胺末端氧化产物，该产物在450 nm处吸附光。自由基（E653nm=3.9 x 104 mol-1 cm-1）和二亚胺（E450nm=5.9 x 104 mol-1 cm-1）的消光系数为HRP和HRP标记探针的测定提供了非常灵敏的系统。ES001是一种单组分试剂，在室温下稳定，对正常实验室光不敏感。对TMB和过氧化氢浓度进行了优化，并与通常用于免疫学分析的HRP浓度产生线性响应。

方法概要：

分析物与固相结合并与HRP标记探针反应完成后，加入ES001。TMB的氧化产生蓝色反应产物，该产物在650 nm处测量。可以记录作为时间函数的颜色形成，或者在固定间隔后用氟化钠终止反应。通过添加酸将蓝色自由基转化为二亚胺，可以提高灵敏度。在450 nm处立即测量产生的黄色。

样本程序

1.使用需要与抗体、探针、HRP标记试剂完成所有必需的孵育。

2.用含0.1%吐温-20的PBS或Tris缓冲盐水清洗平板至少4次。

3.最后一次洗涤后，振摇并吸干平板孔中的全部残留缓冲液。

4.将0.1 mL ES001（TMBE溶液）添加至适当的孔中并孵育5-30分钟。

注意：反应时间将取决于HRP探针的活性。如果颜色变色太快，则零级动力学将不占优势。可能需要稀释探针、抗体或HRP标记试剂。

5.可以将反应作为动力学分析的时间函数进行监测，或者用0.1 mL的0.1%氟化钠终止反应，并在650 nm处读取。

6.如果程序要求转换为黄色二亚胺，则添加0.1 mL上述试剂部分所述的任一酸，并记录5分钟内的吸光度。

时间、试剂体积和温度的变化需要用户进行标准化。

提供的试剂：
含有1.25 mmol/L TMB和2.21 mmol/L过氧化氢以及低于1%二甲基亚砜的0.08 mol/L醋酸盐缓冲液（pH值为4.9）的液体溶液。还含有无毒的专有稳定剂。

所需的物料：
终止反应所需的试剂，但未提供
A. 0.1%氟化钠，用于终止反应并保留蓝色色原。取1 g氟化钠，溶于1升试剂级水中进行制备。使用氟化钠时，请遵守标签上的全部注意事项。

B. 用于终止反应并将蓝色自由基转化为黄色二亚胺的酸。可使用0.5 mol/L硫酸或0.25 mol/L盐酸。必须在加入酸后5分钟内获得吸光度。
注意：试剂级水必须含有低于10^-7 mol/L的铁或铜盐，否则未反应的TMB将非酶促地转化为二亚胺。

色码：黄色

在室温下可储存最长六个月。在2-8°C下可长期储存达12个月。避免暴露在阳光直射下。如果溶液为蓝色或浑浊，则丢弃。

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