Rho相关激酶（ROCK）活性测定

简介：

Rho家族的小GTPase蛋白是细胞行为的几个方面的关键调节因子，例如细胞运动，细胞增殖和凋亡。它们在涉及肌动蛋白细胞骨架和/或微管网络的许多运动反应中起着核心作用，从神经突延伸到吞噬作用和癌细胞侵袭。另外，它们有助于改变导致细胞周期进程或分化细胞反应的基因表达。Rho被细胞外信号（例如溶血磷脂酸（LPA））激活。Rho的作用由下游Rho效应子介导。这些效应子之一是Rho相关的蛋白激酶（ROCK）。已经识别出两种ROCK亚型：ROCK-I（也称为ROKβ）和ROCK-II（也称为Rho激酶和ROKα）。ROCK通过几种底物的磷酸化介导Rho信号传导并重组肌动蛋白细胞骨架，这些底物有助于肌动蛋白丝的组装和收缩。
ROCK通过苏氨酸残基696处肌球蛋白磷酸酶靶亚基1（MYPT1）的特异性磷酸化使肌球蛋白磷酸酶失活，这导致20 kDa肌球蛋白轻链（MLC20）的磷酸化形式增加。该苏氨酸残基也可以被强直性肌营养不良症蛋白激酶（DMPK）家族激酶磷酸化。

测试原理：
Millipore’s Rho相关蛋白激酶（ROCK）活性测定试剂盒是一种酶免疫测定法，用于检测活性ROCK和DMPK家族激酶。用重组MYPT1预涂板，其中包含Thr696残基，在添加ROCK-1，ROCK-II或DMPK后可能会被磷酸化。然后使用仅特异性检测Thr696磷酸化MYPT1的检测抗体。随后，加入HRP偶联的二次检测抗体。 通过添加生色底物四甲基联苯胺（TMB）来测量磷酸化底物的量，该底物结合HRP从无色溶液转变为蓝色溶液（或在添加终止溶液后转变为黄色）。450 nm处的吸光度信号反映了样品中ROCK活性的相对量。

ROCK测定试剂盒旨在确定纯化的ROCK活性的存在和相对量，以及用于筛选ROCK或DMPK家族激酶的抑制剂或激活剂。

Millipore’s Rho相关蛋白激酶（ROCK）活性测定试剂盒是一种酶免疫测定法，用于检测活性ROCK和DMPK家族激酶。用重组MYPT1预涂板，其中包含Thr696残基，在添加ROCK-1，ROCK-II或DMPK后可能会被磷酸化。然后使用仅特异性检测Thr696磷酸化MYPT1的检测抗体。随后，加入HRP偶联的二次检测抗体。 通过添加生色底物四甲基联苯胺（TMB）来测量磷酸化底物的量，该底物结合HRP从无色溶液转变为蓝色溶液（或在添加终止溶液后转变为黄色）。450 nm处的吸光度信号反映了样品中ROCK活性的相对量。

ROCK测定试剂盒旨在确定纯化的ROCK活性的存在和相对量，以及用于筛选ROCK或DMPK家族激酶的抑制剂或激活剂。它也可用于评估药理剂对ROCK或DMPK家族激酶的效价。

MYPT1预包被96孔多条板：一个预先包被MYPT1

抗磷酸-MYPT1（Thr696）抗体的96孔多条板：一个小瓶包含10 µg抗磷酸-MYPT1（Thr696）抗体

TMB/E底物：一瓶包含12 mL

终止溶液：一瓶包含12 mL

TBS，20X：一瓶包含50 mL 20X TBS

20% Tween^® 20（v/v）：一瓶包含3 mL

封板机：两个微孔板包含

分析稀释缓冲液I：一个小瓶包含1 mL

ATP（10mM）：一个小瓶包含50 µL

MgCl2（1M）：一个小瓶包含100 µL

30% BSA：一个小瓶包含1 mL

山羊抗兔IgG HRP二抗：一个小瓶包含30 µL

ROCK抑制剂Y-27632：一个小瓶包含150 µL

活性Rho相关激酶II（ROCK-II）：一个小瓶包含10 µg

在标签和手册上规定的温度下储存试剂盒材料；自接收之日起4个月内使用。

CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany

TWEEN is a registered trademark of Croda International PLC