PTP1B检测试剂盒，比色法

用于测量PTP1B活性的比色分析试剂盒。这种方便的96孔分析可用于筛选PTP1B活性的抑制剂和调节剂。

人重组PTP1B（目录号539735）、PTP1B底物（目录号539737）、检测缓冲液、磷酸盐检测剂、磷酸盐标准品、RK-682抑制剂（目录号557322）½容量板和用户协议。

毒性：多个毒性值，请参阅MSDS（O）

试验时间：2 h

在进行分析之前，请阅读整个方案。仔细记录每个试剂盒组分的处理和储存条件。如有必要，请联系CALBIOCHEM^®技术服务部寻求帮助。



注：以下规程仅供参考。最佳实验条件将因所研究的参数而异，必须由个人用户确定。



Calbiochem PTP1B分析试剂盒，比色法是一种非放射性分析方法，用于测量纯化制剂中的PTP1B活性，并用于抑制剂或激活剂筛选。

1.解冻所有试剂盒组分，并将PTP1B酶、PTP1B底物（IR5）和分析缓冲液置于冰浴上；在室温（RT）下储存红色试剂。通过将88 µl 2X测定缓冲液和88 µl dH₂O添加到500 µg纯肽中复溶PTP1B底物至1.5 mM。涡旋。复溶后，分装并冷冻保存（-70°C）。3.制备磷酸盐标准曲线：a.通过用600 µl dH₂O稀释600 µl 2X测定缓冲液来制备1.2 ml 1X测定缓冲液。b.将移液管分为两组，每组六个孔：100、97.5、95、90、80和70 µl 1X测定缓冲液。c.用移液管将100 µM磷酸盐标准溶液的0、2.5、5、10、20和30 µl按相同顺序移入相同的孔中。d.这些孔将分别含有0、0.25、0.5、1.0、2.0和3.0 nmol无机磷酸盐。注：重复执行标准曲线。

自收到之日起，将1/2体积板在室温下储存，其余成分在-70°C下储存，以保持最高稳定性。为了保持最大的酶活性，必须非常小心地处理PTP1B。在RT水浴中快速解冻，或用手指摩擦解冻，然后立即存放在冰浴中。其余未使用酶应立即置于-70°C下冷冻。为了尽量减少冻融循环次数，将PTP1B等分放入单独的管中，并在-70°C下储存。

用标准曲线将A₆₂₀转化为纳摩尔磷酸盐。1.将标准曲线数据绘制为A₆₂₀nm与nmol PO₄^2-。2.使用适当的例程获得数据的一条或多条直线拟合。请注意，在磷酸盐浓度从0到3 nmol的整个范围内，曲线图可能不是线性的。如下图所示，两个线性拟合，一个用于0至1 nmol磷酸盐，另一个用于1至3 nmol磷酸盐，可以产生A₆₂₀与磷酸盐量的更精确相关性。3.使用适当绘图的斜率和Y截距计算特定数据点的磷酸盐释放量。4.示例（使用下图中的标准曲线进行样品计算）：a）测量的_A620=0.180。由于该A低于图中1 nmol点的值，因此选择0到1 nmol拟合，即y = 6.58x - 0.386。b）用A₆₂₀代替x，并用nmol PO₄^2-代替y，得到：nmol PO₄^2- = 6.58(A₆₂₀) - 0.386nmol PO₄^2- = 6.58(0.180) - 0.386nmol PO₄^2- = 0.798注：为了获得最高的准确度，应为每一组新的分析数据绘制一条标准曲线。这将标准化样品中游离磷酸盐的变化、与绿色试剂孵育的时间以及其他实验因素。时间进程和费率计算1.如上所述，使用标准曲线，将一系列时间点的A₆₂₀测量值转换为nmol磷酸盐。2.绘制磷酸盐的nmol与时间的关系图，并获得以nmol/min为单位的斜率。如果斜率在以后逐渐减小，则将斜率确定中使用的时间点限制在绘图的最早线性部分。3.计算所选底物浓度下每孔所含磷酸肽的总量可能有用。例如，在100 l反应中75 M IR5肽处为：75 x 10^-6 mol/L x 100 x 10^-6 L = 7500 x 10^-12 mol = 7.5 nmol4.尽管在可能的情况下，最好从转化为产物的最初几%的基质中获得初始速率数据，但这可能不会产生足够的信号来进行准确的速率估计。在实践中，PTP1B在75 M IR5底物下，至少前15%的水解底物（~1 nmol磷酸盐）的时间历程图保持线性。测试样品/抑制剂数据1.重要的是获得“时间零点”测量值，并从对照和测试样品/抑制剂值中减去该值（以nmol磷酸盐表示）。同样，获得准确t=0测量值的简便方法是将25 l红色试剂添加并混合到50 l 2X酶中，然后混合到50 l 2X底物中（参见时间过程说明）。2.将活性计算为控制百分比
3.必要时，添加其他对照。例如，虽然极低的读数通常表明试样是一种有效的抑制剂，但该化合物有可能干扰显色。在这种情况下，适当的控制方法是比较从1 nmol磷酸盐（10 l 100 M磷酸盐标准溶液）中获得的显色反应，添加和不添加试验化合物[仅缓冲液，不含酶或PTP1B底物（IR5）]；参见磷酸盐标准曲线说明）。

阳性对照
重组PTP1B

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