脂质过氧化物(LPO)检测试剂盒

一种灵敏可靠的检测试剂盒，可直接利用与亚铁离子的氧化还原反应测量任何含有脂质氢过氧化物的样品中的氢过氧化物。脂质过氧化的定量分析对于评估氧化损伤在病理生理疾病中的作用至关重要。

FTS 试剂 1、FTS 试剂 2、脂质过氧化氢标准液、提取液 R、三苯膦，以及说明书。

毒性：多个毒性值，请参阅 MSDS（O）

试验时间：1.5 h

Calbiochem 脂质氢过氧化物（LPO）检测试剂盒旨在测量任何含有可检测水平的样品类型（例如细胞、组织、植物材料、生物体液）中的脂质氢过氧化物。

1.提取液 R：该小瓶包含用于提取样品的结晶固体。根据如下步骤制备提取液 R 的饱和溶液：称取约 100 mg 萃取物 R 放入试管中，加入 15 ml 甲醇；充分涡旋约 2 分钟。甲醇将变得浑浊，大部分固体仍不溶解。提取液 R 饱和的甲醇溶液应在 2 h 内使用。2.三苯膦：该小瓶含有结晶的三苯膦。称重 2.6 mg 三苯膦，溶解在 1 ml 氯仿：甲醇混合物中（制备方法请参见下文），制备 10 mM 溶液。将溶液密封保存，置于冰上，并在 12 小时内使用 3.显色剂：通过在试管中混合等体积的 FTS 试剂 1 和 FTS 试剂 2，并涡旋来制备显色剂。只需准备足够量的显色剂用于被测样品的量即可；每个试管需要 50 l 显色剂。注：显色剂应现配现用。4.96 孔玻璃板（可选）：每次使用前必须清洁玻璃板。用温肥皂水清洁平皿，然后用 HPLC 级水冲洗，然后用丙酮冲洗。注：请勿使用研磨剂清洁平皿。在用于测定之前，平皿必须完全干燥。5.氯仿，将氮气鼓泡通过溶剂至少 30 分钟，以使约 100 ml 氯仿（未提供）脱氧 。将部分脱氧的氯仿冷却至 0°C ，并将其保存在冰上以萃取样品。一体积样品的萃取需要两体积的氯仿。6.甲醇：将氮气鼓泡通过溶剂至少 30 分钟，以使约 100 ml 甲醇（未提供）脱氧。7.氯仿：甲醇混合物：将两体积的脱氧氯仿与一体积的脱氧甲醇混合。该溶剂混合物即可用于测定。每个测定管大约需要 1 ml 氯仿：甲醇混合物。8.脂质过氧化氢标准品：将脂质过氧化氢标准液储存于 -80°C，并在实验期间将其放置在冰上。准备 24 个干净的试管（玻璃或聚丙烯），标记 A-H，一式三份。如下表所述，将脂质过氧化氢标准品和氯仿：甲醇混合物分装到每个试管中：<div class="Bio_doc_image">
表1：脂质过氧化氢标准
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任何含脂质氢过氧化物的样品均适用于该检测。组织、培养的细胞、植物材料、食物和生物流体（例如，血浆）都可以用于该检测。大多数组织含有过氧化物酶（例如谷胱甘肽过氧化物酶），其可有效地将内源性脂质氢过氧化物还原成其相应的醇。过氧化物酶活性使正常组织中的氢过氧化物浓度降低到极低或无法检测的水平。即使在氧化应激条件下，自由基产生的氢过氧化物也必须超过过氧化物酶的防御能力，然后脂质氢过氧化物的浓度才会增加到可检测的水平。测定脂质氢过氧化物可以反应出进行检测时脂质过氧化的水平。脂质过氧化的积分值（随时间变化的脂质过氧化）可以通过测量 8-异前列腺素水平来更可靠地测定。使用前，应在 HPLC 级水或不含过渡金属离子的缓冲液中匀浆组织、植物材料和食品。使用前，应在 HPLC 级水或不含过渡金属离子的培养基中对培养的细胞进行超声处理。收集后应立即对样品进行分析。如果不能在样品还处于新鲜状态时进行检测，则应提取脂质氢过氧化物，并将提取物储存于 -80°C。提取的脂质过氧化氢在 -80°C 下可稳定保存至少一个月。进行检测前，必须用氯仿从样品中提取脂质过氧化氢。标准的 Bleigh 和 Dyer13 提取方案不可再现，因此不适合进行定量分析。在该试剂盒中，脱蛋白步骤与脂质氢过氧化物的提取相结合，以实现脂质氢过氧化物的定量提取。该提取步骤可确保从样品中去除几乎所有的干扰物质。以下是使用血浆作为样品的典型提取步骤：1.将已知体积的样品（例如，500 µl 血浆）等分到玻璃试管（12 x 75 mm）中。2.向每个试管中加入等体积的提取液 R 饱和的甲醇（本例为 500 µl）并涡旋振荡。3.向每个试管中加入 1 ml 冷的脱氧氯仿，并通过涡旋彻底混合。4.将混合物在 0°C 下离心，1500 x g，5 分钟。5.小心地沿着试管的侧面插入一个巴氏移液管，收集底部的氯仿层。将氯仿层转移到另一个试管中，并保存在冰上。注意：避免在收集氯仿层时收集到中间的蛋白质层或上层水层。携带到试管中的任何水都会干扰颜色的形成。不必收集所有的氯仿层；700 µl 就足够了。

自收到之日起，将脂质过氧化氢标准液储存于 -80°C。试剂盒的其余组件应储存于 4°C。

7.计算结果：a.计算每个脂质过氧化氢标准品和样品的平均吸光度。b.从脂质过氧化氢标准品 A 本身和所有其他脂质过氧化氢标准品和样品中减去脂质过氧化氢标准品 A 的平均吸光度。c.绘制脂质过氧化氢标准品（来自上述步骤 b）的校正吸光度（请参见上方的试剂制备、脂质过氧化氢标准品）随表中最终氢过氧化物值的变化曲线。有关使用分光光度法（图 2）和玻璃 96 孔板法（图 3）的典型标准曲线，请参见下文。<div class="Bio_doc_image">

图2：使用分光光度法的典型标准曲线。
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图3：使用玻璃 96 孔板法的典型标准曲线。
</div>d. 将每个样品的校正吸光度值代入从标准曲线的线性回归中获得的方程式，计算出样品管（HPST）的氢过氧化物值。HPST（nmol）=（样品吸光度-y截距）/斜率。计算原始样品中氢过氧化物的浓度，如下所示。<div class="Bio_doc_image">

图4：计算氢过氧化物的浓度
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阳性对照
13-氢过氧十八烷酸

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