RIPAb+ HuR - RIP经验证的抗体和引物组

使用RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）测定法评估RipAb+抗体。 每组RipAb+抗体均包含定量RT-PCR对照引物（RIP引物），通过成功共沉淀特异性RNA靶标（已知这种特异性靶标）对IP结果进行生物学验证。提供了qPCR方案和引物序列，使研究人员能够在实验环境中使用抗体时验证RIP方案。每组还包括阴性对照抗体，以确保RIP反应的特异性。
RipAb+HuR组包括HuR抗体，阴性对照抗体（纯化的兔IgG）和阳性qPCR引物，可扩增人β肌动蛋白（ACTB）cDNA的100 bp片段。HuR和阴性对照抗体以可扩展的“每个RIP”反应大小提供，可用于功能验证沉淀HuR相关RNA。

表位：氨基酸1-13 HuR

RIP裂解液的免疫沉淀：
使用0.5 μg正常兔IgG或抗HuR抗体对MCF7细胞的RIP裂解液（每个IP 2 X 10⁶细胞当量）进行免疫沉淀。沉淀的蛋白质通过电泳分离，转移到硝酸纤维素膜上并用抗HuR（1.0 μg/mL）进行探测。
使用一步IP-Western试剂盒（GenScript目录号L00231）对蛋白质进行可视化（请参见图）。

蛋白质印迹分析：
通过电泳分离3T3/A31裂解液，转移到PVDF膜上，并用HuR，hu（1:500稀释度）探测。使用与HRP偶联的驴抗兔蛋白可视化，并使用化学发光检测系统可视化。（请参见图）。

免疫沉淀分析：
10 ug该抗体从500 ug 3T3/A31 RIPA裂解液中免疫沉淀的HuR（请参见图）。

免疫细胞化学分析：
使用抗HuR（红色）对HeLa，NIH/3T3进行共聚焦IF分析。肌动蛋白丝已用AlexaFluor 488-鬼笔环肽（绿色）标记。细胞核用DAPI（蓝色）染色（请参见图）。

经RipAb+HuR-RIP验证的抗体&引物组方便地包含抗体&，即特异性对照PCR引物。

RNA结合蛋白免疫沉淀：
使用5 µg正常兔IgG或抗HuR抗体和Magna RIP试剂盒（目录号17-700）对从HeLa细胞制备的RIP裂解液（每个IP 2 x 10⁷细胞当量）进行免疫沉淀。
使用RIP引物ACTB通过qPCR确认了HuR相关RNA的成功免疫沉淀（请参见图）。
请参阅Magna RIP^®（目录号17-700）或EZ-Magna RIP（目录号17-701）方案以获取实验详细信息。

35 kDa

形式：纯化

抗HuR（兔多克隆抗体）。一个小瓶，包含50 μg纯化兔多克隆抗体，溶于100 μL缓冲液中，缓冲液中含有0.05%叠氮化钠和50%甘油中的PBS。在-20°C下液体化。

正常兔IgG。一个小瓶，包含125 μg纯化兔IgG，溶于125 μL含有0.1%叠氮化钠的储存缓冲液。在-20°C下储存。

RIP引物ACTB。一个小瓶，包含75 μL 5 μM人β肌动蛋白（ACTB）特异性引物。在-20°C下储存。
对于： TTG TTA CAG GAA GTC CCT TGC C
REV: ATG CTA TCA CCT CCC CTG TGT G

对照
包括阴性对照兔IgG抗体和人β肌动蛋白（ATCB）特异性对照引物。

MAGNA RIP is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany

UPSTATE is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany