过氧化氢酶的酶学测定（EC 1.11.1.6）

描述

本程序适用于所有过氧化氢酶产品。

本连续分光光度法速率降低测定（A₂₄₀，光程 = 1cm）基于以下反应：

单位定义：一单位过氧化氢酶在pH 7.0、25 ℃下每分钟分解1.0 μmole的H₂O₂，而H₂O₂浓度从10.3 mM降至9.2 mM。通过观察240 nm处吸光度的降低速率来观察H₂O₂的消失速率。

所需试剂和设备

1.0 M磷酸氢二钾溶液（货号：P8584）

1.0 M磷酸氢钾溶液（货号：P8709）

氢氧化钾（货号：P1767）

盐酸（货号：H1758）

过氧化氢 [30% (w/w)，货号：H1009]

比色皿和恒温分光光度计

注意事项

请参阅产品化学品安全技术说明书，获取危害和安全操作方法相关信息。

制备说明（存储 / 稳定性）

使用超纯水（25°C时 ≥ 18 MΩ×cm电阻率）制备试剂。

1. 磷酸盐缓冲液（50 mM磷酸钾缓冲液，pH 7.0，25°C）
   制备200 mL：
   • 将6.15 ml的1.0 M磷酸氢二钾溶液（货号：P8584）加入烧杯中。
   • 加入3.85 ml的1.0 M磷酸氢钾溶液（货号：P8709）。
   • 使用超纯水将最终体积补足至200 ml。
   • 使用1M KOH或HCl在25°C下将pH调节至7.0。
   
   
2. 过氧化氢溶液 [0.036％（w/w）] — 使用过氧化氢 [30％（w/w），货号：H1009] 在磷酸盐缓冲液中制备。使用磷酸盐缓冲液作为空白剂确定该溶液的A₂₄₀。A₂₄₀必须在0.550与0.520吸光度单位之间。如有必要，加入过氧化氢以增加吸光度，或加入磷酸盐缓冲液以降低吸光度。在测定过程中保持溶液在冰上冷却。
   
   
3. 过氧化氢酶溶液 –
   • 过氧化氢酶产品以冻干粉形式提供。
     a. 在冷磷酸盐缓冲液中制备10 mg/ml的初始溶液（该溶液略微混浊）。
     b. 使用前，立即用冷磷酸盐缓冲液稀释至~100 单位/ ml。二次稀释液
   必须每次现配现用。
   • 过氧化氢酶产品以结晶悬浮液形式提供，例如货号C30。
      a. 将产品在37℃孵育约1小时以完全溶解。
      b. 使用正排量移液管，在37°C
   磷酸盐缓冲液中制备~1,000单位/ml的初始稀释液。
      c. 在37°C孵育初始稀释液约1小时，直至溶解（无漩涡）。
      d. 使用前，立即在37°C磷酸盐缓冲液中二次稀释至~100单位/ml。
         二次稀释液必须每次现配现用。

操作流程

最终测定浓度 – 在3.00 ml反应混合物中，最终浓度为：~50 mM磷酸钾，0.036％（w/w）过氧化氢和~10单位过氧化氢酶。

1. 使用A₂₄₀ 和25°C设置的合适的恒温分光光度计，与含有磷酸盐缓冲液的石英比色皿比较将仪器调零。
2. 将2.90 ml过氧化氢溶液吸移到石英比色皿中。
   注意：说明：一次只运行一种试样。
3. 将比色皿放入分光光度计中，使底物平衡至25℃。
4. 然后向比色皿中加入0.10 ml过氧化氢酶溶液。通过倒置立即混合，每秒读取一次读数、共读取约180秒，以监测吸光度的降低。
5. 记录A₂₄₀从0.45降低到0.40吸光度单位所需的时间。
6. 一式三份执行步骤1-5。

结果

计算

式中：

3.45 = 对应于3.0 ml反应混合物中3.45 μmol过氧化氢的分解，A₂₄₀从0.45降至0.40
df = 稀释因子
时间 = A₂₄₀从0.45降低到0.40吸光度单位所需的分钟数
0.1 = 加入比色皿中酶的毫升数