使用SYBR Green I染料检测的qPCR基因表达/拷贝数分析实验方案

PCR 技术方案目录

qPCR条件优化

QPCR 条件的优化对于制定稳健的检测方案非常重要。优化不佳的表现是重复样本之间缺乏再现性，以及检测低效且不灵敏。两种主要优化方法是优化引物浓度和/或退火温度。 

使用 SYBR Green I 染料检测一个或多个稳定内参基因的靶量是qPCR的常见应用。下面是一个可以适应特定实验需要的标准实验方案。

实验目标

在对靶基因和内参基因进行 qPCR 检测优化后便可测量靶标的数量。如数据分析部分所述，确定目的基因 (GOI) 数与稳定内参基因 (s) 数之间的比率是确定的。在本例中，使用标准曲线确定拷贝数。但是，如果不使用标准曲线，相对数量也可以通过其他比较量化分析方法来确定（参见数据分析）。如果采用这种方法，则标准曲线可以省略，但所有测试样本都需增加一个校准样本。方案中包括标准引物浓度和退火温度，但应根据优化实验的结果进行调整（参见引物浓度优化和温度梯度法引物优化）。

设备

• 定量PCR仪器 
• PCR设置的层流罩（选购件）

试剂

• gDNA 10ng - 100ng或cDNA作为模板(低表达基因按1:2稀释，中高表达基因按1:10 - 1:100稀释)。
• KiCqStart SYBR^®Green ReadyMix™（KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03—取决于仪器，参
  见表P4-6）。
• PCR级水：PCR级水（W1754或W4502），20mL等分试样；冻存；每次反应均使用新鲜的等分试样。
• 用于测试基因的正向和反向引物（10 μM储备）。

耗材

• 无菌过滤器移液管吸头
• 无菌 1.5 mL 螺旋盖微量离心管 (CLS430909)
• PCR管和PCR板，选择一种以匹配所需格式：
  •    单个独立的薄壁200μLPCR管（Z374873或P3114）
  •    孔板
        - 96孔板 (Z374903)
        - 384孔板 (Z374911)
  •    孔板密封
        - ThermalSeal RTS™ 封膜 (Z734438)
        - ThermalSeal RT2RR™ 封膜 (Z722553)

本方案注意事项

• 使用随机引发或oligo-dT方法生成cDNA（标准逆转录方案（两步法））。
• 将正向和反向引物稀释至10 μM或根据优化结果确定的合适浓度（参见引物浓度优化和温度梯度法引物优化）。
• 如果使用 PCR 板，请按照板示意图进行操作，以确保将反应混合物、样品和对照物加入到正确的孔中。
• 所有测试都将作为重复反应进行。

方法

1.    为每个引物对准备不同的qPCR反应混合物。为样品准备足够的混合物，标准
曲线反应（下述 6 种稀释度），无模板对照物，全部一式两份，并多算额外10%
以允许移液误差。

       例如，如果有 5 个测试样品，则需准备 (5 × 2) 样品混合物+(6 × 2) 标准曲线+(1 × 2)无模板对照物
(NTC) =24 份反应物。因此每个引物对需准备 26.4 或 27 份反应混合物。

2.    将合适的标准曲线模板/cDNA进行1:10倍(或实验室适用稀释浓度)的连续稀释，
以使每份稀释液均含有 20 μL 模板（共 6种稀释液）。

3.    加入 5 μL 合适模板连续稀释液（标准曲线），样品测试 cDNA 或水 (NTC) 至指定
试管或孔。

4.    每管或每孔加入 15 μL反应混合物。

5.    盖上盖子或密封 PCR 板和标签。（确保标签不会遮蔽仪器的激发/
检测光路。）

6.    根据表 P17-44操作样本。

说明：使用标准解离曲线实验方案（数据收集）。