使用X-tremeGENE HP转染试剂进行慢病毒生产

慢病毒是一种用于在研究应用中转染多种细胞类型的强大工具。在病毒生产期间，实现低滴度和毒性绝非易事。这里介绍的一种易用方案使用X-tremeGENE HP转染试剂进行快速而稳健的慢病毒制备，从而获得高病毒滴度以实现成功的靶细胞转染。

材料

• 包装细胞系
  TLA-HEK293T (Open Biosystems) 该细胞系粘附生长，适用于无血清培养基配方。使用X-tremeGene HP试剂时，不需要适应无血清条件，因为该试剂不会因血清的存在而受影响。细胞应在含有GlutaMAX（Invitrogen）和10％胎牛血清（FBS）的Opti-MEMR中进行培养。将培养容器保持在37℃，10％CO₂和95％RH条件下。
• 表达载体
   pGIPZ (Open Biosystems)，或与表达eGFP或其他合适转基因的第二代/第三代慢病毒包装系统相容的其他载体。
• 包装和包膜质粒
   psPAX2和pMD2.G质粒能够表达产生功能性病毒颗粒所需的蛋白质，对重组具有抗性。

方法

A.慢病毒上清液生产

第1天

1. 用1mL浓度为0.01mg/mL的无菌聚赖氨酸水溶液涂覆在标准6孔细胞培养板的孔上。在室温下孵育至少1小时（+15至 +25 °C）。
2. 用2 mL无菌水洗涤每个孔两次。
3. 在无菌条件下移出水，并对容器进行空气干燥。
4. 在转染前一天将TLA-HEK293T细胞以约40-50％的融合度分别加至包被的孔板中，并将细胞置于2 mL生长培养基（含有GlutaMAX、10％FBS的Opti-MEMR）中生长。

第2天

1. 取出旧的培养基，并加入1.8 mL新鲜培养基。
2. 准备转染混合物：
   A)将表达载体（pGIPZ）、包装载体（psPAX2）和包膜载体（pMD2.G）按摩尔比1：2：2混合，溶于无菌水或TE缓冲液（pH 7.6）至2μg（0.53μg；0.95μg；0.52μg）。

注意：制备得到的质粒应该是高质量且不含内毒素的。
B) 将DNA稀释至0.2 mL转染培养基（无血清Opti-MEM^®培养基）中。
C) 加入6 μL X-tremeGENE HP试剂，短暂涡旋并在室温下孵育15分钟。
3.小心地将转染混合物添加至细胞中，并轻轻搅拌以实现化合物的均匀分布。 

第3天

用2 mL生长培养基替换旧培养基。注：弃去的培养基中含有少量病毒颗粒，应根据生物安全等级2作为废物处理。

第5天

1. 收集含有病毒的上清液并将其转移到1.5 mL无菌小瓶中。
2. 在-2至-8 °C下以2000×g离心10分钟，并将上清液转移至新小瓶中。

B.通过有限稀释确定病毒滴度

第1天

在体积为200 μL的生长培养基中，在聚赖氨酸包被的96孔板的每孔中加入1×10⁴个种子细胞（这里也是TLA-HEK293T）。

第2天

1. 将40 μL含病毒的上清液加入160 μL含有8 μg/mL聚凝胺的生长培养基中。
2. 用另外的90 μL含有聚凝胺的生长培养基稀释10 μL所得病毒溶液。重复该稀释过程至少5次。
3. 除去培养基后，向细胞中加入100 μL稀释液（细胞生长至约60％融合）。
4. 1小时后，每孔加入另外100 μL生长培养基。
5. 转化48小时后对细胞进行分析。对GFP阳性细胞进行计数并乘以稀释因子。

结果

为了确定该方案是否产生适合细胞培养的足够纯和浓缩的病毒，根据上述方法转染细胞。显微镜分析清楚地显示出高水平的GFP表达（<90％），且没有毒性（图1）。

此外，使用产生的含病毒的上清液进行转染后的显微镜分析显示GFP阳性细胞的产量为1.2 x 10⁶ pfu/mL。因此，此处建立的实验方法能够生产合适量的慢病毒。为避免病毒DNA多次插入宿主基因组，建议以低于0.1的感染复数（MOI）感染细胞。利用该实验方法从标准6孔板的一个孔中所获得的病毒量，可用于转染至少10⁷个细胞。

仅用于生命科学研究。不可用于诊断流程。