小分子HPLC

小分子HPLC分析

小分子HPLC分析通常采用反相分离方式。极性化合物分离可选用亲水作用色谱(HILIC)和正相色谱，前者效果更佳。离子化合物分离可选用离子交换分离方法，有机阴离子或阳离子还可选用离子色谱法。

HPLC色谱柱可填充全多孔硅胶颗粒、表面多孔硅胶颗粒、聚合物颗粒，或以整体型硅胶棒作为固定相，也可使用氧化铝、氧化锆颗粒和碳颗粒。分离小分子时，固定相材料孔径范围通常为60Å-160Å。HPLC固定相粒径范围通常为3µm至5µm，UHPLC粒径通常为2µm或更小。固定相可附加不同的柱选择性（修饰）。C18烷基链是反相(RP)色谱法最常用的柱化学修饰。但通过C30、C8、苯基、五氟苯基等其他修饰，大量极性更强的修饰以及具有离子交换或手性的修饰，几乎可分离所有溶于液体的化合物。RP-HPLC的流动相通常含有水相缓冲液或水和水溶性有机溶剂，如乙腈或甲醇。

HPLC样品制备

食品、饮料、化妆品、生物样品等复杂及富含基质的样品，以及富含基质的药物制剂（如乳膏剂、糖浆剂），需要有效的样品制备方法来除去无关组分并选择性提取目标分析物。对于粒径极小的固定相（如粒径2µm以下的UHPLC），尤其需要满足这一要求。常用的样品制备方法有液液萃取、固相萃取(SPE)；对于生物样品，除过滤处理外，还需进行蛋白沉淀。除选择性洗脱目标化合物和预浓缩外，样品制备的主要目标是保护HPLC固定相不会因样品基质造成堵塞。整体型硅胶HPLC色谱柱适用于大量基质，样品制备工作远少于颗粒型色谱柱。 

衍生化

某些小分子需要在HPLC分离前（柱前）后（柱后）进行衍生化。衍生化步骤可将分子转化为衍生物，从而提高HPLC灵敏度或色谱保留性。须根据所需的衍生化反应选用具有所需物理和化学性质的化学试剂。