过滤在(U)HPLC和LC-MS性能优化中的重要性

• UHPLC、HPLC和LC-MS中的过滤
• 不同针头过滤器的颗粒截留
• 经过和未经样品过滤的HPLC色谱柱寿命评估
• 评估用于流动相过滤的滤膜
• 过滤，柱堵塞和HPLC分析
• 推荐产品
• 参考文献

HPLC样品过滤的Millex^®针头过滤器

Millipore^®滤膜和过滤器，用于流动相/溶剂过滤

众所周知，适当的样品制备技术对于高品质数据的获取至关重要。(U)HPLC和LC-MS分析前的样品制备有时会省略过滤步骤，但这会造成不利后果，因为样品和流动相中的颗粒物会破坏色谱柱和仪器的性能。我们研究了Millex^®针头过滤器的颗粒截留能力，并与其他同类产品进行比较，然后将颗粒截留效率（或截留率）与柱寿命相关联，其中在UHPLC系统中进样过滤和未过滤样品，同时监测反压多达500次进样或直至超过设定截止压力。此外，还评估了流动相过滤对柱反压的影响。这些数据证实了过滤在HPLC色谱柱寿命优化中的重要性。

UHPLC、HPLC和LC-MS中的过滤

高效、超高效液相色谱(HPLC, UHPLC)和液相色谱-质谱(LC-MS)技术是药物开发和制药QC、学术和政府研究、食品饮料分析及临床和环境检测的常用分析方法。这些方法涉及最简单、最经济的样品制备技术之一—过滤，即滤除样品中的颗粒物。¹样品中的不溶颗粒物，即使浓度再低，也有可能堵塞HPLC柱子，引起仪器反压升高和柱寿命缩短，并影响数据质量。^2,3因此，过滤去除样品颗粒可以规避这些问题，同时有可能提供更清晰的色谱数据。⁴

过滤对于(U)HPLC和LC-MS的流动相制备来说也同样重要。^5,6,7 市面上的HPLC、UHPLC、LC-MS和MS级别溶剂经过预滤处理，无需额外过滤即可从瓶中直接用作流动相。但是不少分析方法会用到流动相缓冲液或混合溶液，需要加入磷酸盐和乙酸盐等盐类。⁸在这些情况下，建议使用前先过滤缓冲液，⁹并即取即用。⁸

我们研究了各种针头过滤器的截留效率，  并比较了经过和未经样品过滤时的柱寿命。 

不同针头过滤器的截留效率

截留率指过滤时成功除去的样品颗粒物比率，同时也说明了可以穿过滤器进入仪器的颗粒物比率。我们使用4个厂家的针头过滤器评估颗粒截留率。针头过滤器的材质为亲水聚四氟乙烯(PTFE)或再生纤维素(RC)。0.45 μm针头滤器对0.5 μm直径微球、0.2 μm针头滤器对0.24 μm直径微球，用0.05% (v/v)的微球水溶液进行过滤检测。受检针头过滤器每批取n=4，大多数情况下会取多个批次。过滤3 mL微球水溶液后收集滤液，用荧光法或分光光度法（比对6点标准曲线）测定。

表1显示受检4种0.45 μm针头过滤器的截留率。不同膜材质的截留效率不同，再生纤维素最低(48.2+/-4.3%)，PTFE可截留98-100%的聚苯乙烯微球。 

对于HPLC来说，0.45 µm滤膜过滤已经足够。但当色谱柱装填细小颗粒时（例如，亚2µm颗粒，或UHPLC），就需要0.2 μm滤膜。^5,10UHPLC色谱柱由于进样口筛板孔隙率、间隙和管径都变小，更容易发生堵塞。因此，我们也评估了0.2 μm针头过滤器对0.24 μm微球的截留率（表2）。再生纤维素滤器的截留率低于20%，说明80%以上需要滤除的颗粒物都穿过了滤膜。3种亲水PTEF滤器的截留率各不相同，2号生产商(MFR #2)最低，并且批次间一致性也比较差。 

截留率数据说明，相同孔径等级的针头过滤器的样品过滤性能并不一定相同。

经过和未经样品过滤的柱寿命评估

柱寿命评估时，反复进样10 μL过滤或未过滤0.05% (v/v)微球溶液。过滤时采用之前检测过的0.45 μm针头过滤器(n=30)滤入30个HPLC认证样品瓶。大多数情况下检测多个批次。每次进样后，监测反压变化多达500次进样或直至设定截止压力8000 psi。设定截止压力是为了保证系统压力不会超过安全限度。HPLC条件如
表3。

每个0.45 μm针头过滤器每次试验都使用一个新柱子。每次试验时都对管线、进样器、密封件和HPLC系统进行彻底清洗（包括装柱和不装柱），确保完全清除上一次试验后残留系统的颗粒物。每次安装新柱后，先用70:30 乙腈：水(1 mL/min)冲洗系统10分钟，接着用流动相（表3）平衡至系统形成稳定的反压基线，一般约需10-15分钟。

用0.45 μm针头过滤器将0.05% (v/v)的0.5 μm聚苯乙烯微球滤入HPLC认证样品瓶。将滤液进样到UHPLC色谱仪中。每次10 μL，反复进样至到达或超过截止反压(8000 psi)。未过滤样品也直接进样。结果如图1。

图1 .样品过滤对UHPLC系统反压的影响。以过滤和未过滤的0.5 μm微球0.05% (v/v)溶液的进样次数为横坐标，平均反压(psi)为纵坐标绘图。过滤样品来自3种0.45 μm亲水PTFE针头滤器和1种再生纤维素针头滤器，生产商均不同。也进样未过滤样品。

在超过截止压力(8000 psi)之前，未过滤样品仅能进样36次。再生纤维素滤液进样71次后超过截止值。说明颗粒会快速堵塞色谱柱，即使仅进样10 μL也会严重损害柱子寿命。联系上述截留率数据，再生纤维素针头过滤器仅能截留溶液中48%的颗粒，意味着约50%需被滤掉的颗粒物进入了UHPLC系统。PTFE过滤样品全部可进样超过500次，并且柱反压无明显变化。因为如前所述，这种针头滤器可截留近100%的颗粒物。

流动相过滤用滤膜评估

过滤对于(U)HPLC和LC-MS应用的重要性并不仅限于样品过滤。流动相中存在的颗粒物同样也会使(U)HPLC发生严重问题。Joshi等人研究发现，流动相中颗粒清除不彻底同样会增加UHPLC色谱柱的反压（图2）。^7,11该研究中，流动相（50:50 乙腈：水）经聚丙烯(PP)和亲水PTFE滤膜过滤（孔径0.2 μm和0.45 μm），再以0.25 mL/min流速连续流过UHPLC色谱柱，监测反压超600分钟。

图2.UHPLC系统反压(psi)与时间(min)关系图，流动相以0.25 mL/min速度流动600分钟。流动相经0.2 μm和0.45 μm聚丙烯(PP)和PTFE滤膜过滤。（参考文献11 ，经允许复制）

受检的4种滤膜中，0.45 μm和0.2 μm聚丙烯膜过滤的流动相反压升高最多。除了之前讨论过的柱问题，流动相中的颗粒物还会造成仪器组分提前损坏，包括泵止回阀、活塞和密封件。¹²需要特别注意的是，比起进样，在实验中用量高很多的流动相如果存在颗粒物，接触柱子后会加速加剧柱堵塞效应。

滤膜截留影响因素

样品和流动相的过滤是通过滤膜进行的，它作为微孔屏障，通过膜孔按照物理大小排阻基质中的颗粒物。其中的问题是，有时候大于膜标称孔径的颗粒物也能穿过，或者小于孔径的却不能穿过，导致不同的截留结果。

微滤膜不同的膜孔性质，例如形状、大小、频率、分布和对称性，决定了滤膜如何截留特定大小的颗粒。本滤膜截留研究中，孔径相同的来自不同生产商的PTFE滤膜，尤其是0.2 µm孔，对相同的颗粒表现不同的截留效果。可能是因为不同生产商的实际孔径分布和孔隙率更宽或更窄。换句话来说就是，从最小到最大的各孔径可能相差非常大。还有不同供应商的制膜工艺也不同（即使使用相同材料）。因此不同材质，有时候甚至是不同批次的孔形状都不相同，尤其是工艺没有严格控制时。另外，各生产商检测孔隙率和孔径的方法也不相同，检测方法选择很多，包括透气性、起泡点、纯水透过性、BET分析、孔径分析或截留法。

使用针头过滤器进行(U)HPLC和LC-MS样品制备时，需要考虑的不止于颗粒截留率。其他膜特性，包括化学性质和化学相容性、滤膜直径、厚度、外壳以及待过滤溶液和分析物的化学性质，对滤膜的总体性能同样有较大影响。¹³

过滤，柱堵塞和HPLC分析

在(U)HPLC分析之前过滤样品是不错的做法。⁵可以防止色谱柱过早堵塞和仪器反压升高，避免不必要的关机和实验室生产效率损失，同时维护数据质量。截留率的研究结果说明，使用针头过滤器过滤含颗粒样品用于(U)HPLC进样时，不同滤器产品对色谱柱的保护作用不同。

孔径等级相同的针头过滤器可能具有不同的颗粒截留效率。只有选择能高效截留颗粒物的过滤器，才能保护(U)HPLC柱子不会过早堵塞。流动相也需要过滤，因为颗粒物不但能堵塞柱子，随时间累积下来也会导致仪器组件损坏。因此，为了保护HPLC色谱柱寿命并获得一致的高质量数据，一直都要把样品和流动相过滤纳入考虑。