抑肽酶酶活测定

1.目标

建立抑肽酶酶活测定的标准化操作步骤。

2.适用范围

该流程适用于可检测抑肽酶活性的所有产品。

3.定义

3.1 在pH 7.8、25 ^ºC条件下一个胰蛋白酶抑制剂单位(TIU)可将2单位胰蛋白酶活性降低50%，其中一单位的胰蛋白酶每分钟可以水解1.0 μmole的N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐(BAPNA)。

3.2纯水 – 经去离子系统处理的水，在25 ^ºC的电阻率大于或等于18MΩ•cm

4.讨论

抑肽酶可以抑制以下反应：

N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺    ^胰蛋白酶   > Nα-苯甲酰-DL-精氨酰 + 对硝基苯胺

5.责任

分析服务实验室人员应遵循本书面操作流程。

6.安全

有关危险因素及合适的操作注意事项，参阅安全数据说明书（SDS）。

7.操作流程

7.1 条件

温度= 25°C，pH = 7.8，A_405nm，光程= 1 cm

7.2 方法
连续分光光度速率测定

7.3试剂：

7.3.1   200 mM三羟乙基胺缓冲液，20 mM氯化钙，pH 7.8，25 °C（缓冲液）
采用纯水、三乙醇胺盐酸盐（货号如T1502）溶液和二水氯化钙（货号如C3881）制备37.1 mg/mL溶液。在25 ℃下用1 M NaOH调节至pH 7.8。）

7.3.2  N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺溶液（BAPNA）
采用纯水和Nα-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺（货号如B4875）制备1.0 mg/mL溶液。

7.3.2.1 使用前和使用期间，将溶液25 °C储存，确保运行期间核心反应混合物处于25 °C。

7.3.2.2 如果溶液混浊，温和加热继续搅拌（但不要超过65ºC），直至溶液变澄清。请勿使用变黄的溶液，因为这表示底物因过热而出现化学分解。

7.3.3   1 mM 盐酸溶液 (HCl)
在纯水中制备100 mL。 

7.3.4   胰蛋白酶溶液（胰蛋白酶）
临使用前，采用低温的试剂7.3.4（HCl）制备一份含1040-1560单位/mL III型胰蛋白酶的溶液。

7.3.4.1 未抑制情况下的速率必须是具有介于0.08-0.12之间的∆A_405nm/min。采用低温的试剂7.3.4（HCl）制备调整试剂试剂7.3.4（胰蛋白酶）的浓度，直至结果处于此范围内。

7.3.5   0.85% (w/v) 氯化钠溶液（NaCl）
使用纯的货号S0817或同等制剂。

7.3.6   抑肽酶抑制剂溶液（抑制剂）
临使用前，采用低温的试剂（NaCl）制备含0.065-0.080 TIU/mL的溶液。

7.3.6.1 为保证检测有效，抑制百分比(%)必须介于40和60%之间。使用低温试剂7.3.5（NaCl）调整试剂7.3.6（抑制剂）浓度，直至结果处于此范围内。

7.4 测定方法

7.4.1 移取以下试剂到合适的比色皿中：

7.4.3 倒置混匀，等待温度调至25 °C。使用适宜的恒温分光光谱仪监测A_405nm直至最后恒定。然后添加：

7.4.3 立即倒置混匀，记录大约5分钟内的A_405nm增量。根据未抑制试样的最大线性速率获取∆ A_405nm/min值，然后采用相同方法计算抑制试样和空白溶液的A405nm/min。

7.5 计算

式中：
TIU = 胰蛋白酶抑制剂单位
df = 稀释系数
9.96 = 对硝基胺苯在405nm处的摩尔消光系数
RM = 反应混合物

7.6最终检测浓度
在3.00 mL反应混合物中，终浓度为107 mM三乙醇胺、11 mM氯化钙、0.03% (w/v) Nα-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺、0.07 mM盐酸、208-312单位胰蛋白酶、0.057% (w/v)氯化钠和0.013 – 0.015胰蛋白酶抑制剂单位抑肽酶。

8.参考文献 

8.1 Fritz, H., Hartwich, G., Werle, E., Hoppe-Seylers Zeitschrift Für Physiologishche Chemie (Berlin) 345, 150-167 (1966).

8.2 Kassell, B., Methods in Enzymology XIX, 844-852 (1970).